吡格列酮通過抑制髓過氧化物酶保護(hù)高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮功能.pdf

1、研究背景: 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類生命的首敵，目前已成為影響國(guó)人壽命和老年人生存質(zhì)量的重要疾病之一。高脂血癥引起的血管內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化形成的第一步，其主要機(jī)制包括一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)表達(dá)或活性的改變、與NOS激活相關(guān)的輔因子表達(dá)的改變、一氧化氮(nitric oxide，NO)大量生成但其生物利用度卻大大降低等。其中，NO生物利用度降低，NO/cGMP/

2、cGK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受損被認(rèn)為是最為重要的機(jī)制。 大量研究表明，過氧化物酶增殖體激活受體激動(dòng)劑γ(Peroxisome proliferator-activatedreceptorγ，PPARγ)具有抗炎和改善血管內(nèi)皮功能等作用，但其確切機(jī)制還不清楚。由于MPO是炎癥反應(yīng)主要因子之一，而且有研究報(bào)道，PPARγ激動(dòng)劑在不同細(xì)胞可以調(diào)節(jié)MPO基因不同形式的表達(dá)。我們推測(cè)PPARγ激動(dòng)劑是否通過調(diào)節(jié)MPO來改善高脂血癥時(shí)血管內(nèi)皮功能，

3、進(jìn)而延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。 目的: 1、驗(yàn)證我們以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。即，高脂血癥時(shí)，通過NO/cGMP/cGK信號(hào)通路受損導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙； 2、觀察分析MPO是否通過改變血管NO/cGMP/cGK信號(hào)通路介導(dǎo)高脂血癥內(nèi)皮功能障礙； 3、PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮(PIO)是否能夠逆轉(zhuǎn)高脂血癥所導(dǎo)致的血管內(nèi)皮功能障礙。如果可以，是否與調(diào)節(jié)血管MPO有關(guān)。 第一部分MPO介導(dǎo)高脂血癥誘導(dǎo)的大鼠血管內(nèi)

4、皮功能障礙1方法1.1動(dòng)物及分組選用健康雄性Wistar大鼠32只，隨機(jī)分為以下五組： ①普通對(duì)照組(n=8)：僅喂普通飼料八周； ②高脂血癥組(n=8)：喂八周高脂飼料； ③高脂血癥+MPO抑制劑氨苯砜組(n=8)：喂八周高脂飼料，最后6天同時(shí)用氨苯砜腹腔注射； ④高脂血癥+溶劑對(duì)照組(n=8)：喂八周高脂飼料，后6天同時(shí)用DMSO腹腔注射。 結(jié)果： 1、食源性大鼠高脂血癥動(dòng)物模型的建立

5、高脂飲食8周后，高脂飲食大鼠血清CHO、TG、LDL-CHO水平顯著高于高脂飲食之前以及同期普通飲食大鼠血脂水平(表1，表2)。 2、高脂血癥致血管內(nèi)皮功能障礙與正常對(duì)照組相比，高脂血癥組大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)上10-9-10-5mol/LACh誘導(dǎo)血管舒張的logEC50顯著升高，即EC50值顯著降低(P<0.01，圖2a)；同時(shí)，血管最大舒張程度明顯降低(P<0.01，圖1a、圖1b、圖2b)。給予10-10-10-6mol/L累積

6、濃度的SNP(一種外源性NO的供體)后，兩組間的血管張力無明顯差別。 3、高脂血癥誘導(dǎo)的血管NO/cGMP/cGK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受損2.3.1高脂血癥大鼠血管的NO含量減少為了驗(yàn)證與高脂血癥誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，我們測(cè)定了血管組織的NOx含量。與正常對(duì)照組相比，高脂血癥大鼠血管NOx含量明顯降低(P<0.01，圖4)。 4、高脂血癥大鼠血管MPO活性增高為了觀察高脂血癥時(shí)血管MPO的變化，我們檢測(cè)了血管

7、MPO活性。與正常對(duì)照組大鼠相比，高脂血癥使大鼠血管MPO活性顯著升高(P<0.01，圖6)。 5、血管內(nèi)皮功能與MPO活性呈負(fù)相關(guān)血管內(nèi)皮功能與MPO的活性進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ACh誘導(dǎo)血管舒張的logEC50值與MPO活性呈正相關(guān)(r=0.797，P<0.01，圖7)，即ACh誘導(dǎo)血管舒張的EC50值與MPO活性呈負(fù)相關(guān)；ACh誘導(dǎo)的血管最大舒張程度與MPO活性呈負(fù)相關(guān)(r=-0.883，P<0.01，圖8)。

8、6、血管組織Nox和cGMP含量均與MPO活性呈負(fù)相關(guān)為了進(jìn)一步證實(shí)MPO是否與高脂血癥誘導(dǎo)的血管NO/cGMP/cGK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受損的相關(guān)，對(duì)血管組織NOx和cGMP含量與MPO的活性進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，血管組織NOx和cGMP含量均與MPO活性呈負(fù)相關(guān)，其r值分別為-0.768(P<0.01，圖9)和-0.955(P<0.01，圖10)。說明，高脂血癥時(shí)血管MPO活性升高與血管NO/cGMP/cGK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受損及血管內(nèi)皮

9、功能障礙相關(guān)。 7、 MPo抑制劑-氨苯砜降低高脂血癥大鼠血管組織MPO活性為了進(jìn)一步探討MPO在高脂血癥誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙中的作用，我們給予高脂血癥大鼠MPO的抑制劑-氨苯砜。用MPO抑制劑氨苯砜干預(yù)后，高脂血癥大鼠血管MPO活性明顯降低(P<0.01)，而溶劑DMSO對(duì)高脂血癥大鼠血管MPO活性無明顯影響(圖11)。 8、氨苯砜干預(yù)后，高脂血癥誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙減輕與高脂對(duì)照組相比，用氨苯砜干預(yù)后，ACh誘導(dǎo)的血

10、管舒張的logEC50明顯降低(P<0.01，圖12a)；同時(shí)，血管最大舒張程度明顯增高(P<0.01，圖12b、圖14a)。用DMSO干預(yù)后，ACh誘導(dǎo)的血管最大舒張程度增高(P<0.01，圖12b)，而兩組間logEC50值卻無明顯差異(圖12a)。ACh誘導(dǎo)的血管最大舒張程度在氨苯砜組和溶劑對(duì)照組間有明顯差異(P<0.01)。在給予10-10mol/L-10-6mol/L累積濃度的SNP后，血管張力在各組間無明顯差別(圖13、圖1

11、4b)。 9、氨苯砜干預(yù)后，改善高脂血癥誘導(dǎo)的血管NO/cGMP/cGK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路損傷2.9.1氨苯砜干預(yù)后，高脂血癥大鼠血管NO含量升高為了探討與MPO介導(dǎo)的高脂血癥誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙的作用機(jī)制，我們測(cè)定了氨苯砜干預(yù)后血管組織的NOx含量。與高脂血癥組相比，用MPO抑制劑氨苯砜干預(yù)后，高脂血癥大鼠血管NOx含量明顯回升(P<0.01)，而溶劑DMSO干預(yù)組其血管NOx含量無明顯改變(圖15)。 以上結(jié)果提示，高脂

12、血癥時(shí)血管MPO活性增高，進(jìn)而使血管NO/cGMP/cGK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受損，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙。 第二部分吡格列酮通過抑制髓過氧化物酶改善高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮功能障礙1方法1.1動(dòng)物及分組選用健康雄性Wistar大鼠32只，隨機(jī)分為以下五組： ①普通對(duì)照組(n=8)：僅喂普通飼料八周； ②高脂血癥組(n=8)：喂八周高脂飼料，后四周同時(shí)用色拉油(溶劑)灌胃； ③高脂血癥+吡格列酮組(n=8)：喂八周高脂

13、飼料，后四周同時(shí)用吡格列酮灌胃； ④高脂血癥+氨苯砜組(n=8)：喂八周高脂飼料，后四周同時(shí)用色拉油(溶劑)灌胃，最后6天同時(shí)用氨苯砜腹腔注射； ⑤高脂血癥+吡格列酮+氨苯砜組(n=8)：喂八周高脂飼料，后四周同時(shí)用吡格列酮灌胃，最后6天同時(shí)用氨苯砜腹腔注射。 1.2指標(biāo)測(cè)定同第一部分。 結(jié)果： 1、食源性大鼠高脂血癥動(dòng)物模型的建立給予高脂飼料前，大鼠的血脂水平無明顯差異(表1)。高脂飲食4周后，

14、大鼠血脂水平較四周前顯著提高，高脂飲食大鼠血清CHO、TG、LDL-CHO水平顯著高于同期普通飲食大鼠血脂水平(表3)。用吡格列酮干預(yù)(灌胃4周)后，高脂血癥大鼠血脂水平明顯下降(表4、圖17、圖18)。 2、吡格列酮干預(yù)后，高脂血癥誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙減輕與高脂血癥組相比，用吡格列酮干預(yù)后，ACh誘導(dǎo)logEC50明顯降低(P<0.05，圖19a)；同時(shí)，血管最大舒張程度顯著增加(P<0.01，圖19b、圖21a)。各組間S

15、NP誘導(dǎo)的血管舒張無明顯差異(圖20、圖21b)。吡格列酮干預(yù)后高脂血癥大鼠ACh誘導(dǎo)的血管舒張與用MPO抑制劑氨苯砜干預(yù)后ACh誘導(dǎo)的血管舒張無明顯差異，高脂血癥大鼠用吡格列酮和氨苯砜同時(shí)干預(yù)后，其ACh誘導(dǎo)的血管舒張與單純用吡格列酮干預(yù)后的血管舒張無明顯差異(圖19a、圖19b、圖21a)。 3、吡格列酮干預(yù)后，高脂血癥大鼠血管組織MPO活性降低吡格列酮干預(yù)后，高脂大鼠血管MPO活性顯著降低(P<0.01)，且與氨苯砜干預(yù)后

16、的大鼠血管MPO活性無明顯差異(圖22)。 4、吡格列酮干預(yù)后，高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮功能與MPO活性呈負(fù)相關(guān)為了進(jìn)一步證實(shí)MPO在吡格列酮保護(hù)高脂血癥血管內(nèi)皮功能中的作用，對(duì)吡格列酮干預(yù)后各組血管內(nèi)皮功能與MPO的活性進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，ACh誘導(dǎo)血管舒張的logEC50值與MPO活性呈正相關(guān)(P<0.01，圖23)，即ACh誘導(dǎo)血管舒張的EC50值與MPO活性呈負(fù)相關(guān)；同時(shí)，ACh誘導(dǎo)的血管最大舒張程度與MPO活性呈負(fù)相

17、關(guān)(P<0.01，圖24)。 5、吡格列酮干預(yù)后，改善高脂血癥誘導(dǎo)的血管NO/cGMP/cGK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路損傷。 6、吡格列酮干預(yù)后，高脂血癥大鼠血管組織Nox和cGMP含量均與MPO活性呈負(fù)相關(guān)為了進(jìn)一步證實(shí)MPO與吡格列酮逆轉(zhuǎn)高脂血癥誘導(dǎo)的血管NO/cGMP/cGK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受損的直接相關(guān)性，對(duì)吡格列酮干預(yù)后各組血管組織NOx和cGMP含量與MPO的活性進(jìn)行相關(guān)性分析。 以上結(jié)果提示，吡格列酮可能通過抑制M