研究轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白化學修飾在老年性淀粉樣變形成機制中的作用.pdf

1、目的：轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin，TTR)主要由肝臟實質(zhì)細胞和脈絡叢細胞合成與分泌，具有轉(zhuǎn)運甲狀腺素和視黃醇的功能，已證實其為老年性系統(tǒng)性淀粉樣變(senile systemic amyloidosis，SSA)和家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變(familialamyloidotic polyneuropathy，F(xiàn)AP)患者淀粉樣變的前體蛋白。相關研究已證實淀粉樣變成分呈無分枝纖維狀結構，目前對于機體內(nèi)TTR蛋白如何聚合形

2、成淀粉樣變纖維，進而沉積于相應組織器官的形成機制還未闡明。本實驗旨在通過對TTR蛋白化學修飾與淀粉樣變纖維形成之間關系的研究，探討TTR代謝組學在SSA淀粉樣變形成中的作用。
　　 方法：⑴根據(jù)SSA診斷標準，收集確診SSA患者4例。依據(jù)TTR基因庫設計四對外顯子引物，PCR擴增外顯子，同時測序擴增產(chǎn)物，檢測TTR基因是否存在突變。⑵應用ProteomeLab PF-2D系統(tǒng)，緩沖液洗脫范圍為pH8.5～4，以pH每變動0.3為

3、單位，收集不同pH條件下洗脫的蛋白。⑶采用BCA(BicinchoninicAcid)方法，對各個組分蛋白含量進行測定。⑷利用硫磺素T(Thioflavin-T，ThT)能夠與淀粉樣變成分特異性結合的性質(zhì)，對各個收集組分的熒光強度進行分析。⑸采用抗人-TTR抗體，Dot blot檢測各個收集組分中的TTR蛋白。⑹利用超高效液相色譜/四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquidchromatography c

4、oupled with quadrupole-time of flight mass spectrometry,UPLC/Q-TOF MS)技術，解析血清中TTR蛋白代謝組學修飾特點。
　　 結果：①PCR擴增結合基因測序，分析TTR基因四個外顯子來判斷SSA患者TTR基因為均未發(fā)生突變，屬于野生型TTR。②ProteomeLab PF-2D系統(tǒng)分離血清TTR，應用連續(xù)pH梯度洗脫，將血清蛋白劃分為46份，同時監(jiān)測蛋白峰度，發(fā)現(xiàn)

5、SSA患者與健康對照組血清蛋白存在有3個主要蛋白吸收峰。③BCA蛋白定量檢測并未發(fā)現(xiàn)兩組間有明顯不同。④硫磺素T特異檢測淀粉樣變熒光強度試驗，在pH7.8～6.7和pH5.6～4.8部分熒光強度增高，同時TTR免疫反應陽性說明存在淀粉樣變熒光成分。⑤Dot blot鑒定TTR蛋白存在的范圍，發(fā)現(xiàn)SSA患者pI7.83～7.61之間TTR含量較高、對照組在pI7.95～7.72范圍TTR含量較多，提示兩者間TTR蛋白存在化學修飾差異。⑥超

6、高效液相色譜/四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF MS)技術解析分析TTR化學修飾，SSA患者TTR修飾類型Dehydration ST、Phosphoryl STY、Hydroxyl DKNP、Carbamidomethyl C、Phosphopantetheine S和O-GlcNac ST明顯減少。
　　 結論：⑴利用PF-2D技術，依據(jù)蛋白質(zhì)在系統(tǒng)梯度中所呈現(xiàn)的電荷極性洗脫蛋白，在不影響淀粉樣變纖維結構的pH

7、條件下梯度洗脫收集血清TTR蛋白，為進一步研究TTR蛋白代謝修飾與淀粉樣變纖維形成模型奠定基礎。⑵發(fā)現(xiàn)SSA患者血清TTR蛋白修飾類型，Dehydration ST、Phosphoryl STY、Hydroxyl DKNP、Carbamidomethyl C、Phosphopantetheine S和O-GlcNac ST修飾減少，而Th-T結合實驗熒光強度增高。TTR蛋白4個單體間依靠疏水結構吸引彼此形成聚合體，表面為親水基團，上述修