丁苯酞對(duì)血管性癡呆小鼠海馬神經(jīng)元谷氨酸受體及鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的作用研究.pdf

1、目的：血管性癡呆(vascular dementia，VD)由于各種腦血管病引起的獲得性認(rèn)知功能障礙，以學(xué)習(xí)、記憶功能缺損為主要癥狀，可伴有語(yǔ)言、運(yùn)動(dòng)、視空間及人格障礙等。 本文通過(guò)探討谷氨酸受體及鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，觀察丁苯酞治療VD的效果并探討其作用機(jī)制。 方法： 1.采用三次雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎，造成腦組織反復(fù)缺血/再灌注，建立了小鼠VD模型，建立假手術(shù)組排除手術(shù)本身對(duì)小鼠所致的影響，通過(guò)跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)進(jìn)行學(xué)

2、習(xí)和記憶成績(jī)測(cè)試，觀察其行為學(xué)改變；用HE染色觀察海馬病理學(xué)特征變化。 2.采用免疫組化和反轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法測(cè)定各組小鼠海馬谷氨酸AMPA-GluR2蛋白及GluR2 mRNA的變化。 3.采用免疫組化和RT-PCR方法測(cè)定各組小鼠海馬谷氨酸NMDA-NR2B蛋白及NR2B mRNA的變化。4 采用流式細(xì)胞分析技術(shù)測(cè)定各組小鼠海馬細(xì)胞[Ca2+]i變化；Western-Blot及RT-PCR方法檢測(cè)

3、CaMPKⅡ蛋白及mRNA表達(dá)的變化。5 Western-Blot及RT-PCR方法檢測(cè)CREB蛋白及mRNA表達(dá)的變化。 結(jié)果： 1.VD小鼠模型的行為學(xué)評(píng)價(jià)及海馬病理學(xué)特征 3月齡雄性昆明小鼠196只，分為假手術(shù)對(duì)照組、VD模型組、丁苯酞預(yù)防治療組、丁苯酞治療組。采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎，連續(xù)三次腦缺血(20 min)再灌注(10min)，建立VD小鼠模型。術(shù)后29d，各組分別進(jìn)行跳臺(tái)試驗(yàn)及水迷宮實(shí)驗(yàn)，測(cè)試學(xué)習(xí)成

4、績(jī)；術(shù)后30d測(cè)試記憶成績(jī)，HE染色觀察各組小鼠海馬組織病理學(xué)特征。 1.1 學(xué)習(xí)成績(jī)術(shù) 后第29天，分別進(jìn)行跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)，測(cè)試跳臺(tái)試驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間(sec)和錯(cuò)誤次數(shù)(number/5 min)作為學(xué)習(xí)成績(jī)，水迷宮試驗(yàn)游完全程時(shí)間(sec)和錯(cuò)誤次數(shù)(number/3 min)作為學(xué)習(xí)成績(jī)。 跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果顯示：(1) 與假手術(shù)對(duì)照組的反應(yīng)時(shí)間(48.76±9.24)s比較，VD模型組小鼠學(xué)習(xí)階段的反應(yīng)時(shí)間(

5、89.41±12.08)s明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；(2) 與VD模型組的反應(yīng)時(shí)間比較，丁苯酞治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的反應(yīng)時(shí)間(59.68±10.27)s及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的的反應(yīng)時(shí)間(57.23±10.05)s均明顯縮短(P<0.01)；(3) 與假手術(shù)對(duì)照組的錯(cuò)誤次數(shù)(1.23±0.27)比較，VD模型組小鼠學(xué)習(xí)階段的錯(cuò)誤次數(shù)(3.74±0.42)明顯增加(P<0.01)；(4) 與VD模型組的錯(cuò)誤次數(shù)比較，丁苯酞治療組小鼠

6、學(xué)習(xí)階段的錯(cuò)誤次數(shù)(1.52±0.38)及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的的錯(cuò)誤次數(shù)(1.48±0.31)均明顯減少(P<0.01)；(5) 假手術(shù)對(duì)照組、丁苯酞治療組、丁苯酞預(yù)防治療組之間的學(xué)習(xí)成績(jī)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 水迷宮試驗(yàn)結(jié)果顯示：(1) 與假手術(shù)對(duì)照組的游全程時(shí)間(87.32±13.46)s比較，VD模型組小鼠學(xué)習(xí)階段的游全程時(shí)間(145.80±13.29)s明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；(2) 與VD模型組的游

7、全程時(shí)間比較，丁苯酞治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的游全程時(shí)間(101.89±18.38)s及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的游全程時(shí)間(99.18±11.25)s明顯縮短(P<0.01)；(3) 與假手術(shù)對(duì)照組的錯(cuò)誤次數(shù)(16.88±4.19)比較，模型組小鼠學(xué)習(xí)階段的錯(cuò)誤次數(shù)(34.60±5.92)明顯增多(P<0.01)；(4) 與VD模型組的錯(cuò)誤次數(shù)比較，丁苯酞治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的錯(cuò)誤次數(shù)(18.71±4.35)及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠學(xué)習(xí)階段

8、的錯(cuò)誤次數(shù)(17.29±4.82)明顯減少(P<0.01)；(5) 假手術(shù)對(duì)照組、丁苯酞預(yù)防治療組、丁苯酞治療組的學(xué)習(xí)成績(jī)之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。以上結(jié)果提示VD模型小鼠的學(xué)習(xí)成績(jī)降低，丁苯酞可以改善其學(xué)習(xí)成績(jī)。 1.2 記憶成績(jī) 術(shù)后第30天，分別進(jìn)行跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)，測(cè)試跳臺(tái)試驗(yàn)潛伏時(shí)間(sec)和錯(cuò)誤次數(shù)(number/5min)作為記憶成績(jī)，水迷宮試驗(yàn)游完全程時(shí)間(sec)和錯(cuò)誤次數(shù)(number/

9、3 min)作為記憶成績(jī)。 跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果顯示：(1) 與假手術(shù)對(duì)照組的潛伏時(shí)間(148.92±20.83)s比較，VD模型組小鼠記憶階段的潛伏時(shí)間(78.67±19.17)s明顯縮短(P<0.01)；(2) 與VD模型組的潛伏時(shí)間比較，丁苯酞治療組小鼠記憶階段的潛伏時(shí)間(131.41±18.82)s及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠記憶階段的的潛伏時(shí)間(128.57±18.29)s均明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；(3) 與假手術(shù)對(duì)照組的錯(cuò)誤次數(shù)

10、(0.32±0.05)比較，VD模型組小鼠記憶階段的錯(cuò)誤次數(shù)(1.72±0.13)明顯增加(P<0.01)；(4) 與VD模型組的錯(cuò)誤次數(shù)比較，丁苯酞治療組小鼠記憶階段的錯(cuò)誤次數(shù)(0.54±0.08)及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠記憶階段的的錯(cuò)誤次數(shù)(0.50±0.07)均明顯減少(P<0.01)；(5) 假手術(shù)對(duì)照組、丁苯酞預(yù)防治療組、丁苯酞治療組之間的記憶成績(jī)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果提示VD模型小鼠的記憶成績(jī)降低，丁苯酞可以改善其

11、記憶成績(jī)。 水迷宮試驗(yàn)結(jié)果顯示：(1) 與假手術(shù)對(duì)照組的游全程時(shí)間(67.82±8.79)比較，VD模型組小鼠記憶階段的游全程時(shí)間(137.40±11.86)明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；(2) 與VD模型組的游全程時(shí)間比較，丁苯酞治療組小鼠記憶階段的游全程時(shí)間(88.73±9.53)及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠記憶階段的游全程時(shí)間(83.87±8.62)明顯縮短(P<0.01)；(3) 與假手術(shù)對(duì)照組的錯(cuò)誤次數(shù)(9.57±2.91)比較

12、，模型組小鼠記憶階段的錯(cuò)誤次數(shù)(20.90±4.25)明顯增多(P<0.01)；(4)與VD模型組的錯(cuò)誤次數(shù)比較，丁苯酞治療組小鼠記憶階段的錯(cuò)誤次數(shù)(11.17±3.04)及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠記憶階段的錯(cuò)誤次數(shù)(10.27±2.83)明顯減少(P<0.01)；(5) 假手術(shù)對(duì)照組、丁苯酞治療組、丁苯酞預(yù)防治療組的記憶成績(jī)之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 以上結(jié)果提示VD模型小鼠的記憶成績(jī)降低，丁苯酞可以改善其記憶成績(jī)。

13、 1.3 VD小鼠海馬病理學(xué)改變 在光鏡下，(1) 假手術(shù)對(duì)照組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞核大而圓，核仁明顯，細(xì)胞排列較致密整齊。(2) 相比之下，VD模型組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞松散，層次不清，有細(xì)胞缺失現(xiàn)象；炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；部分細(xì)胞旁有空染區(qū)，核固縮、胞質(zhì)濃染、胞體變小，并且有膠質(zhì)細(xì)胞增生形成結(jié)節(jié)。(3) 丁苯酞治療組和預(yù)防治療組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列尚整齊，未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，核固縮現(xiàn)象較少見(jiàn)。 2.VD小鼠

14、海馬CA1區(qū)AMPA-GluR2受體表達(dá)水平及丁苯酞的影響 2.1 AMPA-GluR2免疫組化染色 2.2 AMPA-GluR2 mRNA RT-PCR檢測(cè) 3.VD小鼠海馬CA1區(qū)NMDA-NR2B受體表達(dá)水平及丁苯酞的影響 免疫組化觀察NMDA-NR2B受體的變化，RT-PCR觀察NMDA-NR2BmRNA表達(dá)的變化。方法同2。 3.1 NMDA-NR2B受體免疫組化染色 3.2 N

15、MDA受體mRNA RT-PCR檢測(cè) 4 VD小鼠海馬神經(jīng)元鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及丁苯酞的影響 4.1 VD小鼠海馬神經(jīng)元靜息態(tài)[Ca2+]i的變化及丁苯酞的影響 4.2 VD小鼠海馬神經(jīng)元CaMPK Ⅱ表達(dá)水平的變化特征及丁苯酞的影響 4.3 VD小鼠海馬神經(jīng)元CaMPKⅡ mRNA RT-PCR結(jié)果 5 VD小鼠海馬神經(jīng)元CREB水平變化及丁苯酞的影響 5.1 VD小鼠海馬神經(jīng)元CREB表達(dá)

16、水平的變化特征及丁苯酞的影響 5.2 VD小鼠海馬神經(jīng)元CREB mRNA RT-PCR結(jié)果 結(jié)論： (1) 本實(shí)驗(yàn)建立的VD小鼠模型可模擬人類VD以學(xué)習(xí)和記憶能力缺損為主的認(rèn)知功能障礙，是研究VD比較理想的動(dòng)物模型，對(duì)深入研究VD是可行的。VD模型小鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)病理性變化。 (2) VD小鼠海AMPA-GluR2蛋白和mRNA表達(dá)水平降低，與其學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)下降相一致，提示GluR2表達(dá)水平降低可

17、能參與了VD的發(fā)病。 (3) VD小鼠海馬NMDA-NR2B蛋白和mRNA表達(dá)水平降低，與其學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)下降相一致，提示NMDA-NR2B表達(dá)水平降低可能參與了VD的發(fā)病。 (4) VD小鼠海馬細(xì)胞靜息態(tài)[Ca2+]i升高，CaMPKⅡ蛋白表達(dá)及CaMPKⅡ mRNA水平降低，導(dǎo)致鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)功能紊亂，可能參與了VD的分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制。 (5) VD小鼠海馬神經(jīng)元CREB蛋白及mRNA表達(dá)水平降低，與其學(xué)習(xí)