外周血單核細(xì)胞表型及功能與慢性乙型肝炎免疫低下的相關(guān)性研究.pdf

1、慢性乙型病毒性肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)在我國(guó)是一種嚴(yán)重危害人類身體健康的傳染性疾病,有近3500萬的CHB患者。乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染慢性化及其持續(xù)感染機(jī)制尚未完全闡明,故而臨床上缺乏針對(duì)CHB的有效治療方法。HBV感染慢性化機(jī)制復(fù)雜,HBV感染時(shí)機(jī)體免疫功能低下以致不能有效清除病毒是主要原因。功能性T細(xì)胞損傷是HBV持續(xù)感染的重要特征。T細(xì)胞被激活需要雙刺激信號(hào),均

2、由抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)提供。巨噬細(xì)胞(macrophage,MΦ)和樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)是專職的APC,DC還能夠啟動(dòng)初始T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。單核細(xì)胞(Monocyte,Mo)則是巨噬細(xì)胞(macrophage,MΦ)和樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)的前體細(xì)胞,在淋巴細(xì)胞的極化和增殖中發(fā)揮重要的作用,同時(shí)能夠決定人體與小鼠的初始及記憶性T細(xì)胞的

3、反應(yīng)格局。Mo不但在適應(yīng)性免疫中扮演重要角色,在固有免疫中也發(fā)揮重要作用。Mo具有多種Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR),如表面的TLR2和TLR4等,胞內(nèi)有TLR3等受體表達(dá),能夠感知外來抗原。細(xì)胞外信號(hào)可以被轉(zhuǎn)換成胞內(nèi)的生化事件,引起基因的轉(zhuǎn)錄激活和產(chǎn)物表達(dá)。單核細(xì)胞發(fā)揮作用除了可以通過細(xì)胞的直接作用或表面受體外,還可以分泌相關(guān)的細(xì)胞因子,如腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α

4、,TNF-α)、白介素-6(Interleukine-6,IL-6)、IL-10和IL-12等。目前對(duì)Mo的研究正處于起步階段;國(guó)內(nèi)外都缺乏有關(guān)HBV慢性感染時(shí)Mo的系統(tǒng)性研究資料。因此,了解Mo的功能狀態(tài)非常必要。本課題中,我們以Mo與HBV慢性感染時(shí)機(jī)體免疫功能低下的相關(guān)性為研究目的,從Mo對(duì)抗原感知,免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)三個(gè)階段開展研究。
　　第一部分慢性乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞亞群及TLR表達(dá)分析
　　目的：研究慢性

5、乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞的比例、CD14lowCD16+亞群及表面TLR2、TLR4的表達(dá)量,探討單核細(xì)胞的CD14lowCD16+亞群及TLR與HBV慢性感染之間的相關(guān)性。
　　方法：設(shè)立慢乙肝組(CHB組)和正常對(duì)照組(N組)。在慢乙肝組中篩選慢性乙型肝炎患者20例,未經(jīng)任何抗病毒或免疫調(diào)節(jié)劑治療,除外其他肝臟疾病及自身免疫性疾病;對(duì)照組中以12例健康者作對(duì)照。取外周抗凝血1ml,用流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血Mos及CD14low

6、CD16+亞群的比例和TLR2、TLR4的表達(dá)量。
　　結(jié)果：慢性乙型肝炎患者外周血中Mo的比例為8.53±2.39％,較之對(duì)照組的6.22±1.16%有明顯增高(P<0.05)。Mo亞群CD14lowCD16+在總Mo中所占的比例為14.56±7.31%,明顯高于對(duì)照組的10.47±4.80%(P<0.05);慢乙肝組中表達(dá)TLR2的Mo比例為77.15±13.78%,平均熒光密度(mean flurescence intens

7、ity,MFI)為1358.12±612.49;對(duì)照組TLR2的Mo陽(yáng)性率為77.02±8.31%,MFI為1322.15±251.02,兩組比較無顯著差異(p>0.05);慢乙肝組Mo的TLR4陽(yáng)性率為76.88±10.27%,MFI700.9±428.75;對(duì)照組的MoTLR4陽(yáng)性率是77.84±6.25%,MFI為614.0±235.64。兩組之間比較TLR4的Mo陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率及MFI進(jìn)行比較,顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05

8、)。
　　結(jié)論：1.慢乙肝患者的外周血Mo比例及亞群CD14lowCD16+比例明顯升高,提示單核細(xì)胞與HBV慢性感染有相關(guān)性;
　　2.慢乙肝患者外周血Mo表面的TLR2和TLR4的表達(dá)并沒有明顯改變,提示Mo的TLR2和TLR4可能與HBV的慢性進(jìn)展關(guān)聯(lián)較小。
　　第二部分慢性乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞的B7-H1及CD155轉(zhuǎn)錄水平的分析
　　目的：研究慢性乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞中,B7-H1和CD15

9、5的mRNA表達(dá)水平變化,探討單核細(xì)胞在慢乙肝患者T細(xì)胞功能缺陷中的作用。
　　方法：設(shè)立CHB組和N組。在CHB組中篩選慢性乙型肝炎患者16例,未經(jīng)任何抗病毒或免疫調(diào)節(jié)劑治療,除外其他肝臟疾病及自身免疫性疾病;N組中以10例健康者作對(duì)照。從患者外周血中分離出單核細(xì)胞,以脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激,分別在刺激后0h、6h和24h收集細(xì)胞,制備總RNA,以Real-time PCR方法檢測(cè)B7-H1

10、和CD155 mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：慢性乙型肝炎患者M(jìn)o在LPS刺激前,B7-H1 mRNA量為0.85±0.14,對(duì)照組在刺激前Mo的B7-H1 mRNA量為1.35±0.28,兩組之間比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。LPS刺激6h后,慢乙肝組的B7-H1mRNA量上升至1709±598.9,對(duì)照組則升至31791015,兩組之間比較無明顯差異(p>0.05);LPS刺激后24h,慢乙肝組的B7-H1 mRNA量

11、是1271±492.3,而對(duì)照組的mRNA量是1716±535.84,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。慢性乙型肝炎患者M(jìn)o在LPS刺激后6h,BT-H1的mRNA表達(dá)水平較刺激前有明顯升高,差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),但24h后未有繼續(xù)升高;對(duì)照組的mRNA表達(dá)水平在LPS刺激后6h較刺激前有明顯上升,差異具有顯著性(p<0.05),但是,刺激24h后B7-H1的mRNA表達(dá)水平有明顯下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);慢

12、性乙型肝炎患者M(jìn)o在LPS刺激前,CD155mRNA量為1.52±0.49,對(duì)照組在刺激前,MoCD155的mRNA量為1.34±0.30,兩組之間比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05);LPS刺激后6h,慢乙肝組的CD155mRNA量為1.97±0.41,而對(duì)照組為1.31±0.09,兩組無明顯差異(p>0.05);LPS刺激后24h,慢乙肝組的CD155mRNA量為3.56±0.14,對(duì)照組為6.30±1.30,比較無差異(p>0.0

13、5)。慢性乙型肝炎患者M(jìn)o在LPS刺激后6h,CD155的mRNA表達(dá)水平較刺激前無明顯變化,但是刺激24h后,CD155 mRNA的表達(dá)顯著升高,差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);正常對(duì)照組中Mo的CD155 mRNA水平,在LPS刺激后6h較刺激前無明顯變化(p<0.05),但在刺激24h后,CD155的mRNA水平有明顯升高,差異具有顯著性(p<0.05)。
　　結(jié)論：1.提示B7-H1和CD155與T細(xì)胞的功能受抑制無明顯

14、相關(guān)性;
　　2.B7-H1和CD155為T細(xì)胞抑制性受體的配體,在LPS的刺激后表現(xiàn)為特征各異的時(shí)序性,可能是在不同的階段發(fā)揮作用。
　　第三部分慢乙肝患者外周血單核細(xì)胞LPS刺激后功能分析
　　目的：研究觀察慢性乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞在LPS刺激后,分泌TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12的情況,探討單核細(xì)胞在HBV慢性感染時(shí)炎癥反應(yīng)能力及對(duì)T細(xì)胞功能的影響。
　　方法：設(shè)立CHB組和N組。CHB

15、組中篩選慢性乙型肝炎患者16例,未經(jīng)任何抗病毒或免疫調(diào)節(jié)劑治療,排除其他肝臟疾病及自身免疫性疾病;N組中以10例健康者作對(duì)照。從外周血中分離出單核細(xì)胞,以LPS刺激,刺激后0h、6h及24h分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,用ELISA方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12的濃度。
　　結(jié)果：1.TNF-α的ELISA結(jié)果:
　　1.1.兩組間比較:LPS刺激前,CHB組TNF-α濃度為38.83±7.69pg

16、/ml,N組是35.40±7.72pg/ml,兩組間沒有明顯差異(p>0.05);刺激后6h,CHB組濃度升至5654±1350pg/ml,N組為10320±51.05pg/ml,N組顯著高于CHB組(p<0.05);刺激后24h,CHB組TNF-α濃度為6384±175.9pg/ml,N組是14770±780.0pg/ml,明顯高于CHB組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);
　　1.2.不同時(shí)間點(diǎn)的比較:CHB組中,LPS刺激

17、后6h的TNF-α濃度顯著高于LPS刺激前(p<0.05);N組中,LPS刺激后6h的TNF-α濃度也顯著高于刺激前(p<0.05),刺激后24h的濃度較刺激后6h有顯著升高(p<0.05)。
　　2.IL-6的ELISA結(jié)果:
　　2.1.兩組間比較:LPS刺激前,CHB組的濃度為1.804±0.60pg/ml,N組是1.103±0.76pg/ml,兩組之間沒有顯著差異(p>0.05);刺激后6h,CHB組的IL-6濃度升

18、至1133±68.91pg/ml,N組為1069±26.93pg/ml,兩組差異不顯著(p>0.05);刺激后24h,CHB組IL-6濃度為1084±11.81pg/ml,N組的濃度是1600±16.79pg/ml,對(duì)照組明顯高于CHB組,差異有顯著性(p<0.05);
　　2.2.不同時(shí)間點(diǎn)的比較:慢乙肝組中,LPS刺激后6h的IL-6濃度明顯高于LPS刺激前,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);對(duì)照組中LPS刺激后6h的IL-6

19、濃度明顯高于刺激前,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),LPS刺激后24h的IL-6濃度較刺激后6h的濃度也有顯著升高(p<0.05)。
　　3.IL-10的ELISA結(jié)果:
　　3.1.兩組間比較:LPS刺激前,CHB組的濃度為4.61±2.01pg/ml,N組是13.14±4.39pg/ml,兩組之間沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05);刺激后6h,CHB組的IL-10濃度升至380.4±66.4pg/ml,N組則為861.

20、4±157.8pg/ml,對(duì)照組明顯高于慢乙肝組(p<0.05);刺激后24h,CHB組IL-10濃度為4241±914pg/ml,N組的濃度是2214±557.2pg/ml,組間比較無差異(p>0.05);
　　3.2.不同時(shí)間點(diǎn)的比較:慢乙肝組中,LPS刺激后6h濃度明顯高于刺激前(p<0.05),LPS刺激后24h的IL-10濃度明顯高于刺激后6h(p<0.05);正常對(duì)照組中,LPS刺激后6h的IL-10濃度明顯高于LPS

21、刺激前,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),刺激后24h的濃度較刺激后6h的濃度也有顯著升高(p<0.05)。
　　4.IL-12的ELISA結(jié)果:
　　4.1.兩組間比較:LPS刺激前,CHB組的濃度為8.87±1.70pg/ml,N組是9.78±0.65pg/ml,組間比較無差異(p>0.05);刺激后6h,CHB組的IL-12濃度升至21.40±2.96pg/ml,N組則為21.70±13.23pg/ml,組間比較無差異

22、(p>0.05);刺激后24h,CHB組IL-12濃度為11.03±0.37pg/ml,N組的濃度是16.80±1.56pg/ml,組間比較無差異(p>0.05);
　　4.2.不同時(shí)間點(diǎn)的比較:慢乙肝組中,LPS刺激后6h的IL-12濃度明顯高于LPS刺激前,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);對(duì)照組中,LPS刺激后6h的IL-10濃度明顯高于刺激前,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　結(jié)論：1.LPS刺激后,單核細(xì)胞有