ERK信號通路在超抗原SEB誘導(dǎo)兒童單個核細胞糖皮質(zhì)激素抵抗中的作用.pdf

1、目的:建立超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)在體外誘導(dǎo)兒童外周血單個核細胞(PBMCs)對糖皮質(zhì)激素產(chǎn)生抵抗的模型。并探討ERK信號通路在該模型中的作用。
　　 方法：1.密度梯度離心法提取正常兒童外周血單個核細胞(PBMCs),用10 g/ml植物血凝素(PHA)或不同濃度(10，100，500，1000ng/ml)金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)分別刺激培養(yǎng)72h，MTT法檢測細胞增殖率，計算刺激指數(shù)(SI)。2.(10

2、-9-10-6)mol/L DEX分別加入10 g/mlPHA或10 ng/ml，100 ng/ml，500ng/ml SEB刺激組PBMCs培養(yǎng)72h，通過檢測細胞增殖率，判斷是否產(chǎn)生激素抵抗。3.將1 mol/LERK抑制劑(U0126)或1 mol/LP38MAPK抑制劑(SB203580)分別加入100ng/ml SEB＋10-6 mol/L DEX組細胞共孵育72h，通過細胞增殖率變化，判斷阻滯上述信號途徑是否對激素抵抗產(chǎn)生影

3、響。4.間接免疫熒光與激光共聚焦顯微鏡觀察不同組別PBMCs中糖皮質(zhì)激素受體(GRα)的亞細胞定位，通過計算核漿比，定量反映GRα核轉(zhuǎn)位來說明對激素抵抗的影響及機制。5.Western-blot觀察100ng/ml SEB刺激組和10 g/mlPHA刺激組ERK活化時程。
　　 結(jié)果：1.MTT結(jié)果表明，10-1000ng/ml的濃度范圍內(nèi)SEB與10μg/ml PHA刺激的PBMCs刺激指數(shù)(SI)無明顯差異。2.10-6 m

4、ol/L DEX作用于10 ng/ml，100 ng/ml，500ng/ml SEB刺激組細胞增殖率分別為80.2[％]，86.6[％]，89.7[％]，而作用于PHA組細胞增殖率為1.8[％]，與PHA組相比p<0.01，說明超抗原SEB使細胞對DEX減少增殖的作用出現(xiàn)抵抗，而PHA則無。3.加入1μmol/L ERK抑制劑(U0126)共孵育72h，100ng/ml SEB組細胞對終濃度為10-6 mol/L DEX其增殖率由86.

5、6％降至2.1[％]，而加入1μmol/LP38MAPK抑制劑(SB203580)細胞增殖率為80.1[％]，說明U0126基本消除了超抗原SEB誘導(dǎo)的激素抵抗作用，而SB203580無此效應(yīng)。4.激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn),PHA刺激組無DEX作用時GRα主要分布在胞漿(核漿比1.21),加入DEX后趨向分布于胞核(核漿比1.67)。而SEB刺激組DEX作用前后GRα均趨向分布于胞漿(核漿比分別為1.20，1.18)。1 mmol/L的ER

6、K抑制劑U0126預(yù)處理細胞2 h，能促進SEB＋DEX組GRα的胞漿向胞核的轉(zhuǎn)運，增加核內(nèi)分布，核漿比由1.18增至1.56(p<0.01)。而P38MAPK抑制劑SB203580對DEX作用前后GRα的亞細胞分布沒有明顯影響。5.Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)與PHA相比，SEB可更早更強誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化，作用1分鐘后即出現(xiàn)p-ERK1/2，且表達持續(xù)時間顯著長于PHA，在24h仍維持在高水平表達。
　　 結(jié)論：超抗