實(shí)驗(yàn)性大腦皮層梗死后EphB2對神經(jīng)再生和血管增生的影響.pdf

1、研究背景： 腦梗死后神經(jīng)再生和血管增生機(jī)制盡管尚未明確，但可能與神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、促紅細(xì)胞生成素、Notch通路等有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)EphB2可促進(jìn)SVZ Nestin陽性細(xì)胞活化，提示EphB2可能是腦梗死后細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)因素。然而，這些增殖細(xì)胞是否具有向神經(jīng)元分化的潛能、梗死灶周神經(jīng)再生以及EphB2是否調(diào)節(jié)腦梗死后血管增生尚未明確。此外，EphB2對腦梗死后遠(yuǎn)隔部位細(xì)胞增生和血管新生的作用如何？本研

2、究擬在前期工作基礎(chǔ)上進(jìn)一步闡明這些問題。 研究目的： 本課題擬首先觀察局灶性大腦皮層梗死后內(nèi)源性神經(jīng)再生和血管增生情況；進(jìn)而利用滲透性微泵持經(jīng)側(cè)腦室持續(xù)給予外源性EphB2-Fc，評估干預(yù)EphB2對大腦皮層腦梗死后神經(jīng)功能的影響；探討EphB2對大腦皮層梗死后SVZ、梗死灶周和遠(yuǎn)隔部位神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)作用；進(jìn)而探討EphB2對腦梗死后SVZ、梗死灶周及丘腦血管增生的可能作用。因此，本研究有助于揭示腦梗死后神經(jīng)再生和血管增

3、生的可能調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，并為腦梗死后促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料和方法： 采用體重70～90g SD大鼠240只按照本課題組方法建立易卒中型腎性高血壓大鼠模型。RHRSP術(shù)后10周，選取血壓>180mmHg，且無自發(fā)性腦卒中表現(xiàn)的高血壓大鼠198只建立右側(cè)大腦中動(dòng)脈皮層支閉塞模型。MCAO術(shù)后24h隨機(jī)選取6只進(jìn)行TTC顯色以明確梗死灶位置和分布。按照隨機(jī)化原則分為4組：MCAO組、MCAO+EphB2-Fc組和IgG

4、—Fc組；假手術(shù)組大鼠僅暴露大腦中動(dòng)脈而不凝閉。MCAO術(shù)后24h MCAO+EphB2-Fc組大鼠利用滲透性微泵經(jīng)側(cè)腦室給予重組小鼠EphB2-Fc；IgG—Fc組大鼠采用同樣方法給予相同劑量的重組人IgG—Fc作為對照。 各組大鼠MCAO術(shù)后7d、14d和21d分別進(jìn)行神經(jīng)功能評分后選取8只取材后進(jìn)行冰凍切片。Nissl染色評估梗死灶體積：免疫組織化學(xué)方法觀察EphB2、ephrinB2的表達(dá)以及側(cè)腦室注射后外源性EphB2

5、-Fc在腦內(nèi)的分布；免疫熒光檢測各組大鼠MCAO術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)SVZ BrdU、BrdU/Nestin、BrdU/DCX、BrdU/GFAP、BrdU/NeuN和PSA—NCAM陽性細(xì)胞數(shù)；梗死灶周和同側(cè)紋狀體BrdU、BrdU/NeuN陽性細(xì)胞及丘腦BrdU陽性細(xì)胞；檢測SVZ、梗死灶周及丘腦BrdU/Laminin陽性細(xì)胞評價(jià)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。 全部數(shù)據(jù)采用SPSS11.5 for windows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

6、 結(jié)果： 1.TTC顯色 為明確梗死灶的位置和范圍，MCAO術(shù)24h隨機(jī)選取6只大鼠進(jìn)行TTC顯色. 2.EphB2的表達(dá)及外源性EphB2-Fc的分布 免疫組化結(jié)果顯示：EphB2表達(dá)于SVZ，細(xì)胞形態(tài)較小，沿側(cè)腦室壁分布，MCAO術(shù)后7d、14d同側(cè)SVZ EphB2表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯減少，其后逐漸升高，MCAO術(shù)后21d恢復(fù)至假手術(shù)組水平。免疫熒光雙標(biāo)顯示：梗死灶同側(cè)SVZ EphB2表達(dá)于

7、BrdU+細(xì)胞；EphB2配體ephrinB-2表達(dá)于vWF陽性血管。經(jīng)側(cè)腦室注射EphB2-Fc后免疫熒光。 3.EphB2-Fc對腦梗死后神經(jīng)功能和梗死灶體積的影響 MCAO術(shù)前1周和術(shù)后1、2、3周各組大鼠采用神經(jīng)功能嚴(yán)重程度評分和平衡木行走試驗(yàn)分別評價(jià)總體神經(jīng)功能嚴(yán)重程度和運(yùn)動(dòng)平衡功能。假手術(shù)組大鼠未見任何神經(jīng)功能缺損。MCAO組大鼠術(shù)后7d、14d和21d NSS和平衡木試驗(yàn)評分顯示大鼠神經(jīng)功能明顯低于假手術(shù)

8、組。 4.EphB2-Fc與腦梗死后SVZ神經(jīng)再生和血管增生 4.1.EphB2-Fc與腦梗死后SVZ細(xì)胞增殖 免疫熒光檢測BrdU陽性細(xì)胞評價(jià)新生細(xì)胞。結(jié)果顯示：MCAO術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)MCAO和IgG—Fc組大鼠同側(cè)SVZ BrdU陽性細(xì)胞數(shù)均無顯著差異。 4.2.EphB2-Fc與腦梗死后SVZ新生細(xì)胞表型 免疫熒光檢測同側(cè)SVZ增殖細(xì)胞Nestin、DCX、GFAP和NeuN的表達(dá)評價(jià)新生細(xì)胞

9、向神經(jīng)或膠質(zhì)細(xì)胞分化情況。Nestin主要表達(dá)于神經(jīng)干細(xì)胞，結(jié)果顯示：MCAO術(shù)后同側(cè)SVZ存在少量BrdU+/Nestin+細(xì)胞，沿SVZ側(cè)壁和前角分布。EphB2-Fc干預(yù)后梗死灶同側(cè)SVZ BrdU+Nestin+細(xì)胞明顯增加。 4.3EphB2-Fc與腦梗死后細(xì)胞遷移 免疫熒光檢測嗣側(cè)SVZ PSA—NCAM+細(xì)胞，結(jié)果顯示：假手術(shù)組SVZ前角存在少量PSA—NCAM+細(xì)胞。MCAO術(shù)后PSA—NCAM+細(xì)胞增

10、多，并以SVZ前角周圍最為明顯，并可見PSA—NCAM+細(xì)胞沿胼胝體向梗死灶方向遷移。EphB2-Fc組梗死灶同側(cè)SVZ前角和胼胝體下PSA—NCAM+細(xì)胞顯著增多，可見大量PSA—NCAM+/BrdU+細(xì)胞。 4.4.EphB2-Fc與腦梗死后SAZ血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖 BrdU標(biāo)記增殖細(xì)胞，Laminin標(biāo)記血管，BrdU+/Laminin+細(xì)胞則提示血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示：假手術(shù)組梗死灶同側(cè)SVZ未見BrdU+/

11、Laminin+細(xì)胞。 4.5.EphB2-Fc與腦梗死后SVZ血管密度 采用FITC—dextran顯示微血管密度和血管通透性。結(jié)果顯示：MCAO術(shù)后梗死灶同側(cè)SVZ側(cè)壁、前角及胼胝體處血管密度較假手術(shù)組有所增多；而EphB2-Fc干預(yù)后梗死灶同側(cè)SVZ可見大量綠色熒光顯示的血管。 5.EphB2-Fc與梗死灶周神經(jīng)再生和血管增生 5.1.EphB2-Fc與梗死灶周神經(jīng)再生 采用BrdU、Neu

12、N分別檢測增殖細(xì)胞和成熟神經(jīng)元，BrdU+/NeuN+細(xì)胞則提示新生成熟神經(jīng)元。結(jié)果顯示：MCAO術(shù)后腦梗灶周存在少量BrdU+細(xì)胞。 5.2.EphB2-Fc與梗死灶周血管內(nèi)皮增殖 假手術(shù)組大鼠幾乎未觀察到BrdU+/Laminin+細(xì)胞，而MCAO術(shù)后梗死灶周BrdU+/Laminin+細(xì)胞增多；經(jīng)側(cè)腦室EphB2-Fc干預(yù)后梗死灶周BrdU+/Laminin+細(xì)胞數(shù)較IgG—Fc組大鼠明顯增多。 5.3.E

13、phB2-Fc與梗死灶周血管密度 假手術(shù)組大鼠大腦皮層可見正常血管分布。MCAO術(shù)后梗死灶中心無血流灌注，而且梗死灶周血管密度顯著下降：EphB2-Fc干預(yù)后梗死灶周血管密度較IgG—Fc對照組顯著增多，而且血管增生區(qū)血管周可見明顯FITC—dextran熒光。 6.梗死灶周神經(jīng)可塑性 Western blot檢測SYN和GAP—43評價(jià)梗死灶周軸突再生。結(jié)果顯示：MCAO術(shù)后2周時(shí)梗死灶周SYN和GAP—43

14、表達(dá)較假手術(shù)組均明顯增多，而MCAO術(shù)后3周時(shí)逐漸降低至假手術(shù)組水平；EphB2-Fc干預(yù)組大鼠MCAO術(shù)后2周時(shí)梗死灶周SYN和GAP—43表達(dá)均顯著高于IgG—Fc組。 7.遠(yuǎn)隔部位血管增生和細(xì)胞增殖 7.1.EphB2-Fc與梗死灶同側(cè)丘腦血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖 假手術(shù)組丘腦腹后核未見明顯BrdU+/Laminin+細(xì)胞，而MCAO術(shù)后梗死灶同側(cè)VPN存在少量BrdU+/Laminin+細(xì)胞。 7.2.E

15、phB2-Fc與梗死灶同側(cè)丘腦血管密度 FITC—dextran顯示VPN微血管密度和血管通透性。結(jié)果顯示：MCAO術(shù)后3周內(nèi)梗死灶同側(cè)VPN血管密度較假手術(shù)組均明顯增多；EphB2-Fc干預(yù)后梗死灶同側(cè)VPN血管密度較IgG—Fc組顯著增多，而且血管密度的增加在MCAO術(shù)后1周時(shí)較為明顯，術(shù)后2周達(dá)到高峰，并可持續(xù)至MCAO術(shù)后3周；高倍鏡下血管增生區(qū)血管周可見明顯FITC—dextran熒光。 7.3.EphB2-

16、Fc與梗死灶同側(cè)丘腦細(xì)胞增殖 免疫熒光檢測腦梗死后同側(cè)VPN BrdU+細(xì)胞。結(jié)果顯示：假手術(shù)組丘腦VPN幾乎未觀察到BrdU+細(xì)胞，而MCAO術(shù)后1周梗死灶同側(cè)VPN BrdU+細(xì)胞明顯增多；EphB2-Fc干預(yù)后同側(cè)VPN BrdU+細(xì)胞顯著多于IgG—Fc組，而且BrdU陽性細(xì)胞多分布在血管周。BrdU陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示：MCAO術(shù)后3周內(nèi)同側(cè)VPN BrdU+細(xì)胞較假手術(shù)組均明顯增加；EphB2-Fc干預(yù)后梗死灶同側(cè)VPN

17、 BrdU+細(xì)胞較IgG—Fc組顯著增加，術(shù)后14d時(shí)增加最為明顯，其后逐漸下降，但在MCAO術(shù)后21d仍高于IgG—Fc組。 結(jié)論： 1.大腦皮層梗死后SVZ、梗死灶周存在神經(jīng)再生；EphB2-Fc干預(yù)后明顯促進(jìn)梗死灶同側(cè)SVZ細(xì)胞增殖、遷移、分化以及梗死灶周神經(jīng)再生，表明EphB2調(diào)節(jié)腦梗死后神經(jīng)再生。 2.大腦皮層梗死后SVZ、梗死灶周存在血管增生；EphB2-Fc能夠促進(jìn)同側(cè)SVZ和腦梗死灶周血管內(nèi)皮細(xì)胞