PEMX對三種淀粉樣蛋白的聚集及其細胞毒性的影響和Aβ1-16的聚集特點及細胞凋亡反應的研究.pdf

1、目的：
　　 2型糖尿病、瘋牛病(CJD)、遺傳性腎淀粉樣蛋白變性疾病與阿爾茨海默病的共同點是此四種疾病都是由于淀粉樣蛋白非正常聚集，導致相關的器官功能障礙。它們相關的蛋白分別是胰淀素（Amylin）、朊蛋白(Prion protein，PrP)、溶菌酶(Lysozyme)和Aβ。現(xiàn)有的研究已表明，正是因為相關的蛋白聚集過多，才最終導致了上述幾種疾病的發(fā)生。對于這幾種疾病的治療，其中一個共同通路就是找到能抑制蛋白聚集或使蛋白解聚

2、的物質，從而使這些蛋白在體內的量減少，以預防和治療疾病。
　　 Amylin是由37個氨基酸殘基組成的多肽激素，又稱Islet Amyloid Polypeptide（IAPP）。Amylin的表達或分泌異常會導致amylin的局部水平升高，從而聚集形成寡聚體，最終形成胰島淀粉樣沉淀。PrPc是可傳播性海綿狀腦病病原體，它有兩種異構體，分別是存在于正常細胞的PrPc和引起動物及人類朊蛋白病的PrPsc。PrPsc可促進PrPc轉

3、化為PrPsc。人體內PrP增殖可能是一個PrPc分子與一個PrPsc分子結合，形成一個雜合二聚體或三聚體，此二聚體會轉化成兩個PrPsc分子，再依次呈指數(shù)增殖。PrPsc聚集過度就會導致瘋牛病。腎淀粉樣蛋白變性疾病屬于非神經性組織淀粉樣變性病，其臨床癥狀之一即蛋白質錯誤折疊形成有規(guī)則的蛋白質聚集體，即淀粉樣纖維。產生這種疾病的蛋白就是溶菌酶( Lysozyme)。本研究以上述三種蛋白為對象，探討Peptide Monomer X(PE

4、MX)在體外對它們的聚集及細胞毒性的影響。
　　 另外，在探討AD發(fā)病機制的實驗過程中發(fā)現(xiàn)Aβ1-16也有聚集和細胞毒性，進而探討了Aβ1-16在不同條件下的聚集狀態(tài)，以及在AD鼠腦組織中能否導致細胞凋亡。
　　 實驗方法：
　　 1、PEMX對Amylin的聚集和毒性的影響
　　 (1)硫磺素T(ThT)方法檢測不同濃度PEMX對Amylin聚集的影響；
　　 (2)透射電鏡(TEM)觀察加入不

5、同濃度PEMX后Amylin聚集形態(tài)的差異；
　　 (3)細胞毒性分析實驗(MTT法)檢測PEMX對Amylin所致細胞毒性的影響。
　　 2、PEMX對PrP的聚集和毒性的影響
　　 (1)硫磺素T(ThT)方法檢測不同濃度PEMX對PrP聚集的影響；
　　 (2)透射電鏡(TEM)觀察加入不同濃度PEMX后PrP聚集形態(tài)的差異；
　　 (3)細胞毒性分析實驗（MTT法）檢測PEMX對PrP所致

6、細胞毒性的影響。
　　 3、PEMX對Lysozyme的聚集和毒性的影響
　　 (1)硫磺素T(ThT)方法檢測不同濃度PEMX對Lysozyme聚集的影響；
　　 (2)透射電鏡(TEM)觀察加入不同濃度PEMX后Lysozyme聚集形態(tài)的差異；
　　 (3)細胞毒性分析實驗（MTT法）檢測PEMX對Lysozyme所致細胞毒性的影響。
　　 4、Aβ1-16在不同的條件下聚集狀態(tài)及細胞凋亡反應

7、
　　 (1)利用原子力顯微鏡(AFM)檢測在不同孵育條件下Aβ1-16是否聚集以及聚集狀態(tài)；
　　 (2)TUNEL法檢測細胞凋亡及促凋亡因子BAX與抗凋亡因子Bcl-2表達量的變化。
　　 結果：
　　 1、PEMX對Amylin的聚集和毒性的影響
　　 (1)ThT，TEM的結果表明PEMX抑制Amylin的聚集；
　　 (2)MTT的結果表明，隨著PEMX的濃度增加，其抑制Amyl

8、in毒性的作用也增強。
　　 2、PEMX對PrP的聚集和毒性的影響
　　 (1)ThT，TEM的結果表明PEMX抑制PrP的聚集，但作用不甚明顯；
　　 (2)MTT的結果表明，PEMX低濃度時便能減少PrP的細胞毒性。
　　 3、PEMX對Lysozyme的聚集和毒性的影響
　　 (1)ThT，TEM的結果表明PEMX明顯抑制Lysozyme的聚集；
　　 (2)MTT的結果表明，PE

9、MX較高濃度時能減少Lysozyme的細胞毒性。
　　 4、AFM檢測Aβ1-16的聚集狀態(tài)變化
　　 Aβ1-16單獨孵育三天即可形成纖維，在不同的PH值，離子強度，孵育濃度與溫度等情況下，也能形成纖維，但是纖維狀態(tài)不同
　　 5、Aβ1-16與細胞凋亡的關系
　　 與對照組相比，腦腔注射Aβ1-16的C57小鼠，腦組織神經細胞凋亡明顯增多，促凋亡因子Bax也增加，抗凋亡因子Bcl-2減少