蛋白激酶D在高血壓主動脈重塑中的作用及分子機制研究.pdf

1、背景：高血壓是心血管疾病最重要的危險因素，而血管重塑是導致高血壓患者心血管事件發(fā)生率顯著增加的獨立危險因素。與高血壓相伴隨的血管結構和功能的改變即高血壓血管重塑，主要包括管壁增厚、管壁管腔比值增大和小血管減少，以及隨之產(chǎn)生的血管功能異常。血管重塑不僅僅是一種代償反應，也是高血壓的主要病理基礎之一，是引起高血壓各種嚴重并發(fā)癥以及循環(huán)系統(tǒng)功能紊亂的重要原因。血管重塑可導致一系列的臨床事件，如高血壓、動脈粥樣硬化和血管狹窄等。目前的研究表明，

2、高血壓主動脈重塑是死亡率增加的主要原因之一。因此預防和改善血管重塑也是高血壓治療的主要目標之一和評價高血壓治療效果的重要指標。血管重塑的發(fā)病機制和防治措施已成為國內外的研究熱點。高血壓血管重塑是一個非常復雜的病理過程，其確切的機制仍不十分明確。研究發(fā)現(xiàn)，血管重塑涉及多個細胞過程的變化，如細胞肥大、增殖、調亡、重塑、炎癥反應、氧化應激、細胞因子的活化、細胞外基質產(chǎn)生與降解等。高血壓主動脈重塑的中心環(huán)節(jié)是因血管平滑肌細胞肥大導致的血管中膜增

3、厚。蛋白激酶D(PKD)家族是一種新發(fā)現(xiàn)的Ca2+/鈣調蛋白依賴性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要包括PKD1、PKD2，PKD3三個成員。PKD結構與酶的活性均和PKC家族不同。越來越多的證據(jù)表明，PKD介導的信號通路在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，尤其在調節(jié)心肌收縮、心室肥厚及重塑中的作用。最近的研究顯示血管平滑肌細胞也表達PKD，且PKD的活性能被一些刺激因素激活，如血管緊張素Ⅱ，血小板源性生長因子和血栓素等。用血管緊張素Ⅱ刺激血管平滑

4、肌細胞時，PKD通過ATl/PKCδ途經(jīng)被激活。另外有研究證實PKD可通過使組蛋白去乙酰酶5(HDAC5)磷酸化介導血管緊張素Ⅱ誘導的血管平滑肌細胞肥大。然而，PKD在自發(fā)性高血壓大鼠主動脈組織中的活性表達及其在主動脈重塑中的作用機制還不是很明確。高血壓患者經(jīng)常伴隨血脂代謝紊亂，因此他汀類藥物在高血壓患者中應用廣泛。越來越多的證據(jù)表明，他汀類藥物除了能夠有效降低血脂水平外，還能發(fā)揮其降脂以外的多項心血管保護效應，如：改善血管內皮功能、穩(wěn)

5、定動脈粥樣硬化斑塊、抗炎抗氧化以及阻止心室肥厚、改善心室重塑等。無論患者血脂是否正常，應用他汀類藥物均能降低心血管疾病的致殘率和死亡率。最近的研究表明，阿托伐他汀能抑制心肌肥厚及纖維化。然而，它在血管重塑中的保護作用及其具體機制還不是很清楚。本課題動態(tài)觀察高血壓大鼠主動脈組織中PKD表達和活化特點及其與主動脈重塑的關系；研究PKD在高血壓主動脈重塑中的作用機制；初步探討阿托伐他汀對高血壓主動脈重塑的改善作用及其分子機制。旨在從分子角度闡

6、明高血壓血管重塑的發(fā)病機制和他汀類藥物改善血管重塑的機制。為高血壓血管重塑的防治提供新思路和理論依據(jù)。
　　 目的：⑴明確自發(fā)性高血壓大鼠主動脈重塑的發(fā)生發(fā)展過程；⑵探討自發(fā)性高血壓大鼠主動脈組織中蛋白激酶D的活性表達在血管重塑中的作用。⑶評價阿托伐他汀在改善高血壓主動脈重塑發(fā)生發(fā)展中的作用及與PKD的關系。
　　 方法：8周齡WKY大鼠40只、自發(fā)性高血壓(SHR)大鼠50只。WKY大鼠隨機分為四組，A組：8周齡(n=

7、10只)；B組：16周齡(n=10只)；C組：24周齡(n=10只)，G組：WKY安慰劑(n=10只)。SHR大鼠隨機分為五組：D組：8周齡(n=10只)；E組：16周齡(n=10只)；F組：24周齡(n=10只)；H組：SHR安慰劑(n=10只)；I組：SHR阿托伐他汀(ATV)50mg·kg-1·d-1(n=10只)。以標準大鼠飼料喂養(yǎng)及普通飲水。另外，WKY安慰劑組、SHR安慰劑組及SHR阿托伐他汀治療組，自16周齡開始每天以蒸餾

8、水或阿托伐他汀分別灌胃，持續(xù)8周。于8、16、24周處死動物，留取胸主動脈組織標本備用。實驗過程中，進行以下檢測：(1)各組大鼠每隔2周測量體重、心率及尾動脈血壓一次；(2)分別于喂養(yǎng)前、喂養(yǎng)至16周、24周抽血測定空腹血脂；(3)HE、Masson及天狼腥紅染色，觀察主動脈壁內膜結構、中膜厚度、彈力纖維和膠原沉積變化；(4)測量主動脈壁中層厚度(MT)、內徑(LD)、膠原體積分數(shù)(VFC)，并計算MT/LD比值；(5)計算羥脯氨酸含量

9、；(6)ELISA法檢測炎癥因子IL-6和TNF-α；(7)Western blot法檢測硝基酪氨酸、PKD、p-PKD744/748、p-PKD916蛋白的表達。
　　 結果：①實驗過程中共有2只大鼠死亡，SHR大鼠組16及24周齡組各一只。在普通喂養(yǎng)周期內死亡。SHR阿托伐他汀治療組無死亡。共88只大鼠完成實驗，其中WKY組40只，SHR組48只。②喂養(yǎng)前，各組大鼠心率、血脂均無顯著差異(P>0.05)；SHR大鼠尾動脈收縮

10、壓高于WKY大鼠，差異顯著(P<0.05)。WKY大鼠的血壓在整個喂養(yǎng)過程中無明顯升高，與WKY組比較，SHR大鼠血壓隨周齡逐漸升高，差異有顯著性意義(P<0.05)；SHR阿托伐他汀治療組尾動脈收縮壓明顯降低，有顯著性差異(P<0.05)。實驗前各組大鼠血甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)間差異無顯著性統(tǒng)計學意義(P>0.05)。SHR阿托伐他汀組血清TC及LDL均較WKY安慰劑

11、、SHR安慰劑組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，TG和HDL-C變化不明顯(P>0.05)。③HE染色顯示：WKY大鼠血管壁無明顯增厚，平滑肌細胞體積較小，大小均一，排列整齊，中膜層彈力纖維排列有序，內膜均一，無增厚；SHR大鼠中膜明顯增厚，中膜內平滑肌細胞肥大，形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，彈力纖維層扭曲，內皮細胞排列紊亂，內膜略有增厚，部分內皮細胞有脫落。隨著周齡的增加，上述表現(xiàn)愈加明顯。阿托伐他汀組與SHR安慰劑組相比較，內、

12、中膜結構均明顯改善，內膜較平滑均一，中膜增厚明顯減弱，平滑肌細胞肥大減退，排列較規(guī)則，中層彈力纖維結構較完整有序。Masson染色顯示：WKY組彈力纖維排列整齊，膠原增生不明顯；SHR組膠原纖維明顯增多，彈力纖維減少、排列紊亂甚至斷裂；阿托伐他汀組與SHR安慰劑組相比較，膠原增生減少，彈力層增多，排列較整齊。天狼腥紅染色顯示：與WKY對照組相比，SHR組隨著周齡增加，Ⅰ型膠原纖維和Ⅲ型膠原顯著增加，阿托伐他汀組比SHR安慰劑組膠原纖維明

13、顯減少。④與WKY組比較，SHR組MT、MT/LD、VFC均顯著增加(P<0.05)；阿托伐他汀組較SHR安慰劑組MT、MT/LD、VFC顯著降低(P<0.05)。⑤WKY大鼠在整個喂養(yǎng)過程中，羥脯氨酸含量無明顯增加。與WKY組比較，SHR組羥脯氨酸隨周齡顯著增加(P<0.05)；阿托伐他汀組較SHR安慰劑組羥脯氨酸顯著降低(P<0.05)。⑥與WKY組比較，SHR組IL-6和TNF-α均顯著增加(P<0.05)；阿托伐他汀可明顯降低I

14、L-6和TNF-α(P<0.05)。⑦硝基酪氨酸是氧化應激的標志物，與WKY組相比，SHR組硝基酪氨酸表達明顯增加(P<0.05)；阿托伐他汀可明顯降低硝基酪氨酸表達(P<0.05)。⑧與同周齡WKY對照組相比，SHR8、16、24周齡組大鼠主動脈組織中p-PKD744/748、p-PKD916表達明顯升高(P<0.05)；隨著周齡的增加SHR組p-PKD744/748、p-PKD916表達水平逐漸升高(P<0.05)。同期WKY各組大

15、鼠的p-PKD744/748、p-PKD916沒有顯著性變化。SHR阿托伐他汀組p-PKD744/748、p-PKD916較SHR安慰劑組的表達減弱，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SHR各組總的PKD表達無明顯變化。
　　 結論：⑴SHR大鼠隨著喂養(yǎng)時間延長呈增齡性主動脈重塑，為高血壓主動脈重塑發(fā)病機制的研究提供了可靠的動物模型平臺。⑵SHR大鼠主動脈組織中磷酸化PKD的表達隨著主動脈重塑過程逐漸升高，提示磷酸化PKD參與了自發(fā)