白細(xì)胞介素6人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控.pdf

1、目的:間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是一類中胚層來(lái)源的多能干細(xì)胞,具有多向分化、造血支持及促進(jìn)干細(xì)胞植入等功能。隨著對(duì)其認(rèn)識(shí)的不斷深入,其免疫調(diào)節(jié)特性也越來(lái)越多地引發(fā)了研究者的關(guān)注[1,2];近來(lái),MSC更是被作為免疫損傷性疾病的理想治療策略而被廣泛研究[26,27,28,29]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)體外預(yù)處理的人胎兒來(lái)源MSC可有效保護(hù)伴刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷病情進(jìn)展,其作用機(jī)制可能與白細(xì)

2、胞介素6(interleukin-6,IL-6)表達(dá)增高有關(guān)。經(jīng)檢索文獻(xiàn),未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究擬采用多種策略,調(diào)控IL-6在MSC中的表達(dá),為進(jìn)一步確證其是否是MSC保護(hù)免疫性肝損傷中的關(guān)鍵分子奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:采用膠原酶消化貼壁傳代法,自人胎兒臍帶Wharton層獲取細(xì)胞,經(jīng)三代以上穩(wěn)定傳代后,行形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面標(biāo)記分子及定向誘導(dǎo)分化予以鑒定。通過(guò)慢病毒IL-6高/低表達(dá)載體轉(zhuǎn)染、腫瘤壞死因子α(tum

3、or necrosis factor,TNF-α)和干擾素γ(interferon,IFN-γ)單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用等策略,上調(diào)/下調(diào)IL-6在MSC中的表達(dá),PT-PCR、real-time PCR鑒定基因表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1臍帶來(lái)源MSC的分離鑒定
　　 1.1原代細(xì)胞可在5至14天形成細(xì)胞集落,細(xì)胞最初表現(xiàn)為兩種形態(tài),多部分為成纖維細(xì)胞樣,一小部分為內(nèi)皮細(xì)胞樣,后者在傳代中將逐步消失,至第4代以后,呈現(xiàn)

4、典型的梭形生長(zhǎng)形態(tài)。
　　 1.2流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示,間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志CD29、CD90及CD105陽(yáng)性表達(dá);HLA-DR及造血細(xì)胞標(biāo)志CD34陰性表達(dá)。
　　 1.3脂肪樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化后,分離獲取的細(xì)胞胞質(zhì)中可出現(xiàn)大小不一的脂滴,油紅染色后呈現(xiàn)紅色;成骨樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化后,細(xì)胞可逐漸變方,Von Kossa染色結(jié)果顯示,胞漿內(nèi)有棕黑色區(qū)域。提示該細(xì)胞具有脂肪樣和成骨樣細(xì)胞分化潛能。
　　 上述結(jié)果提示,我們

5、從臍帶獲取的細(xì)胞具有MSC典型特征,可用于下一步研究。
　　 2慢病毒IL-6表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 2.1以質(zhì)粒pLXSN/IL-6為模板,PCR擴(kuò)增IL-6片段,與T載體相連接,轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后,測(cè)序鑒定,結(jié)果顯示序列正確。提示IL-6基因與T載體連接成功。
　　 2.2 IL-6基因與慢病毒pBPLV載體相連接,轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后,測(cè)序鑒定,結(jié)果顯示序列正確。提示慢病毒IL-6表達(dá)載體(pBPLV/IL-6)構(gòu)建成功。

6、r>　　 3慢病毒IL-6表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MSC
　　 RT-PCR結(jié)果顯示,慢病毒IL-6表達(dá)載體(pBPLV/IL-6-MSC)的IL-6表達(dá)水平較慢病毒空載體轉(zhuǎn)染的MSC及未轉(zhuǎn)染MSC(pBPLV-MSC;MSC)顯著增高(p＜0.05);
　　 real-time PCR結(jié)果亦顯示,pBPLV/IL-6-MSC組IL-6表達(dá)水平顯著高于pBPLV/MSC組和MSC組(p＜0.05);
　　 上述結(jié)果提示,p

7、BPLV/IL-6轉(zhuǎn)染可顯著上調(diào)IL-6基因表達(dá)。
　　 4慢病毒IL-6干涉載體轉(zhuǎn)染MSC
　　 RT-PCR結(jié)果顯示,慢病毒IL-6干涉載體(pSicoR/IL-6-MSC)的IL-6表達(dá)水平較慢病毒空載體轉(zhuǎn)染的MSC及未轉(zhuǎn)染MSC(pSicoR-MSC;MSC)顯著降低(p＜0.05);
　　 real-time PCR結(jié)果亦顯示,pSicoR/IL-6-MSC組IL-6表達(dá)水平顯著低于pSicoR-MSC

8、組和MSC組(p＜0.05);
　　 上述結(jié)果提示,pSicoR/IL-6轉(zhuǎn)染可顯著下調(diào)IL-6表達(dá)。
　　 5 ConA刺激的小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)MSC IL-6表達(dá)的影響
　　 RT-PCR、real-time PCR結(jié)果均顯示不同濃度小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清處理后UCMSC IL-6表達(dá)水平均高于對(duì)照組(p＜0.05);
　　 RT-PCR、real-time PCR結(jié)果均顯示同一濃度小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清處

9、理后UCMSC于不同時(shí)間點(diǎn)IL-6表達(dá)水平均高于對(duì)照組(p＜0.05);
　　 上述結(jié)果提示,ConA刺激的小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清可顯著上調(diào)IL-6表達(dá)。
　　 6細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ聯(lián)合以及單獨(dú)應(yīng)用對(duì)MSC IL-6表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示不同濃度TNF-α和IFN-γ聯(lián)合應(yīng)用其IL-6表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(p＜0.05);
　　 RT-PCR、real-time PCR結(jié)果顯示同一濃度TNF-α和

10、IFN-γ聯(lián)合以及TNF-α單獨(dú)應(yīng)用后UCMSC各時(shí)間點(diǎn)IL-6表達(dá)水平均高于對(duì)照組(p＜0.05),而IFN-γ單獨(dú)應(yīng)用后各時(shí)間點(diǎn)IL-6表達(dá)水平均低于對(duì)照組(p＜0.05)。
　　 上述結(jié)果提示,TNF-α和IFN-γ聯(lián)合應(yīng)用以及TNF-α單獨(dú)應(yīng)用可上調(diào)IL-6表達(dá),而IFN-γ單獨(dú)應(yīng)用則下調(diào)IL-6表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1采用膠原酶消化貼壁傳代法,可自人胎兒臍帶Wharton層成功獲取合格的MSCC；