人參皂苷Rh1改善糖皮質(zhì)激素抵抗的實驗研究.pdf

1、背景：
　　 糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids，GC)是目前臨床應(yīng)用較多的一類藥物，廣泛用于炎癥及免疫相關(guān)疾病的治療，但是臨床上有相當(dāng)一部分病人的激素療效并不理想。由于GC的藥理作用主要是通過糖皮質(zhì)激素受體(glococorticoidreceptors，GR)介導(dǎo)發(fā)揮的，因此有研究認為GR的表達及其結(jié)和力是GC療效的決定因素之一。如果GR表達或結(jié)合力處于一種較低的狀態(tài)，即使體內(nèi)GC水平很高，實際能與GR結(jié)合形成配體受

2、體復(fù)合物的GC數(shù)量卻有限，故激素的生物效應(yīng)仍然較低。我課題組研究發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)激素抵抗的系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人外周血單個核細胞GR的表達及結(jié)合力就明顯低于激素敏感的病人。對于這部分病人，通常采用補充大劑量糖皮質(zhì)激素，或者給予免疫抑制劑聯(lián)合治療的方法提高其療效。然而，大劑量GC和免疫抑制劑的使用可以引起各種副作用的發(fā)生。而且長期大劑量應(yīng)用激素又會進一步導(dǎo)致GR表達減少和結(jié)合力降低，從而加大后續(xù)治療的難度。因此，尋找一種有效調(diào)節(jié)GR的藥物一直是近年

3、來研究的熱點。
　　 近年來，中藥在臨床治療中的地位越來越受到重視，我科室在前期研究中發(fā)現(xiàn)人參中主要有效成分人參總皂苷(ginsenosides，GSS)在體內(nèi)外具有上調(diào)GR，并增強激素效應(yīng)的作用。隨后的臨床研究也證實，GSS可以增強系統(tǒng)性紅斑狼瘡的糖皮質(zhì)激素療效，在不影響療效的前提下有助于GC的減量。但是總皂苷成份復(fù)雜，包含了Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Ro、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、20(S)-Rh

4、2、20(R)-Rh2、F1、F2等40余種單體皂苷，不利于臨床推廣和機制研究。因此，本研究將從總皂苷中篩選出一種或幾種具有上調(diào)GR作用的單體，觀察其在體內(nèi)外對糖皮質(zhì)激素抵抗的改善作用，并做初步機制探討。
　　 本科題研究目的：1、從成分復(fù)雜的GSS中篩選能夠上調(diào)GR表達和結(jié)合力的一種或幾種單體，并篩選出上調(diào)效果最強的單體；2、以地塞米松(dexamethasone，Dex)作為陽性對照，觀察該單體在體內(nèi)外對糖皮質(zhì)激素抵抗的炎癥

5、模型的作用，并對其機制做初步探討。
　　 本課題采用的方法：
　　 1.采用Western-Blot、定量RT-PCR法篩選具有上調(diào)GR表達的單體，并運用放射性配基結(jié)合實驗檢測其對GR結(jié)合力的上調(diào)作用。
　　 2.體外觀察Dex聯(lián)合人參皂苷單體的抗炎作用，并初步探討其分子機制。
　　 (1)我們先用Dex(1uM)聯(lián)合人參皂苷單體(10uM)及單用Dex(1uM)預(yù)處理細胞2h(短期作用組，非激素抵抗模型

6、)或者24h(長期作用組，激素抵模型)，再用TNF-α干預(yù)8h，然后運用定量RT-PCR技術(shù)檢測炎癥因子IL-6、IL-17、MMP-1、TNF-αmRNA的表達，對比Dex聯(lián)合人參皂苷單體與單用Dex在不同條件下的抗炎效果。
　　 (2)為了探討Dex聯(lián)合人參皂苷單體優(yōu)于單用Dex的抗炎機制是否與NF-κB通路有關(guān)，我們設(shè)立短期作用組(2h)及長期作用組(24h)，TNF-α干預(yù)，相同條件下，采用Western-Blot技術(shù)觀

7、察其抗炎作用是否通過影響P65通路發(fā)揮。
　　 (3)因為人參皂苷單體能夠抑制GR蛋白表達及結(jié)合力的下調(diào)，我們運用雙熒光素酶報告基因法觀察其是否增強GRE的轉(zhuǎn)錄激活。同時用Dex聯(lián)合人參皂苷單體及單用Dex處理肝原代細胞，觀察GR的數(shù)量及結(jié)合力的提高是否會激活與高血糖相關(guān)的酶，因此我們運用定量RT-PCR法檢測糖異生相關(guān)基因G-6-P、PEPCK，觀察其是否處于高表達狀態(tài)。
　　 3.DBA-1關(guān)節(jié)炎癥模型小鼠驗證所選單

8、體的體內(nèi)抗炎效果。
　　 牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑混合物誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型，將模型小鼠隨機分組分成生理鹽水(Nerative)組、Dex(1.5mg/kg·d)組、Dex(1.5mg/kg·d)+Rh1(25mg/kg·d)組，連續(xù)給藥14天。每天觀察小鼠關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)情況，并給予評分，治療結(jié)束后觀察血糖，定量RT-PCR法檢測GR、G-6-P、PEPCK的表達。
　　 結(jié)果表明：1.人參總皂苷中三個單體Rh1，Rb1，Rb3

9、具有抑制GR表達和結(jié)合力下調(diào)的作用，其中Rh1作用最為明顯；
　　 2.體外研究顯示，人參皂苷Rh1與Dex聯(lián)合應(yīng)用對TNF-α誘導(dǎo)生成的炎癥因子IL-6、IL-17、MMP-1、TNF-αmRNA表達具有明顯的抑制作用(P<0.01)，即使對Dex處理24h后的細胞(激素抵抗模型)，該聯(lián)合方案也具有明顯的抑制作用，而單獨使用Dex則抑制炎癥作用減弱。進一步研究發(fā)現(xiàn)，無論是在激素抵抗還是非激素抵抗模型中，人參皂苷Rh1聯(lián)合Dex

10、均可以抑制P65核轉(zhuǎn)位，抑制IkB磷酸化，而單獨使用Dex對激素抵抗的P65通路則無抑制作用。以上作用與Rh1抑制GR表達和結(jié)合力下調(diào)密切相關(guān)。由于Rh1具有抑制GR的下調(diào)作用，雙熒光素酶報告基因結(jié)果也顯示與Dex組相比，Rh1聯(lián)合Dex可以輕微增強GRE的轉(zhuǎn)錄激活，但有趣的是，對GRE激活的糖異生相關(guān)基因G-6-P、PEPCK，Rh1聯(lián)合Dex卻沒有激活作用。體內(nèi)研究采用DBA-1關(guān)節(jié)炎模型小鼠，研究證實，與單獨給予Dex比較，Rh1