褐飛虱紅色復(fù)眼的突變機(jī)理研究.pdf

1、褐飛虱（Brown planthopper，BPH），Nilaparvata lugens Stal，屬半翅目飛虱科，是亞洲許多地區(qū)水稻上的重要害蟲(chóng)之一。褐飛虱正常眼色為褐色，在室內(nèi)長(zhǎng)期飼養(yǎng)的農(nóng)藥敏感品系中偶見(jiàn)紅眼突變體。作為可見(jiàn)的遺傳標(biāo)記，褐飛虱紅眼突變體具有多種潛在應(yīng)用價(jià)值。明確突變體的生物學(xué)特征及突變機(jī)理將有助于此突變體應(yīng)用價(jià)值的探索。
　　前期研究結(jié)果表明，紅眼表型受常染色體上一對(duì)隱性等位基因的調(diào)控，其眼黃素含量?jī)H為野生型

2、個(gè)體的36.3％，色素顆粒數(shù)量及電子致密度也顯著下降。為了靶標(biāo)基因的準(zhǔn)確定位，本研究首先構(gòu)建了褐飛虱褐眼野生型和紅眼突變型近等基因系，然后以近等基因系為材料從基因及蛋白水平對(duì)褐飛虱紅眼突變的機(jī)理進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1.褐飛虱紅眼突變體的種群參數(shù)比較
　　本部分首先通過(guò)1代雜交和8代自交試驗(yàn)篩選了褐飛虱紅眼突變型和褐眼野生型的近等基因系，命名為NIL-rr和NIL-BB。生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，NIL-BB的生存力

3、及繁殖力顯著下降，而NIL-rr和普通的室內(nèi)褐眼種群(BB)相似。其中，NIL-BB的單雌產(chǎn)卵量及卵孵化率兩參數(shù)的顯著降低是其種群適合度下降的主要原因。BB、NIL-rr和NIL-BB的種群趨勢(shì)指數(shù)分別為52.18、43.80和4.19。另外，NIL-rr品系初羽化雌成蟲(chóng)的體重和體長(zhǎng)也顯著重/長(zhǎng)于NIL-BB品系。相對(duì)于NIL-BB，NIL-rr較強(qiáng)的繁殖力及較大的體型可能是因?yàn)檠凵蛔兓蚧蚱渚o密連鎖基因?qū)Ψ敝尘哂休^強(qiáng)的補(bǔ)償作用。本研

4、究結(jié)果表明，NIL-rr并不具有生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，或可用作田間研究材料。意外獲得的具有較低繁殖力和生命力的NIL-BB品系試蟲(chóng)可用作生殖相關(guān)信號(hào)通路的研究模型。
　　2.褐飛虱眼色相關(guān)基因的克隆
　　為了進(jìn)一步定位突變基因，本部分在前期獲得的4個(gè)基因片段的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用生物信息學(xué)、熱啟動(dòng)PCR和RACE技術(shù)克隆了10個(gè)眼色相關(guān)基因，其中有7個(gè)基因通過(guò)RACE技術(shù)獲得了全長(zhǎng)序列，包括5'-和3'-UTR，有3個(gè)基因還未獲得全長(zhǎng)序列

5、。同源比對(duì)表明，這些基因都與其他昆蟲(chóng)的直系同源物具有較高的一致性，也存在典型的特征序列，因此認(rèn)為它們編碼蛋白就是相對(duì)應(yīng)果蠅眼黃素合成通路的色氨酸加氧酶（vermilion）、犬尿氨酸甲酰胺酶、犬尿氨酸羥化酶(cinnabar)和酚額嗪酮合成酶（karmoisin），色素轉(zhuǎn)運(yùn)通路的White（white）和Scarlet(scarlet)半轉(zhuǎn)運(yùn)子，色素顆粒形成通路的接頭蛋白復(fù)合體AP3的4個(gè)亞基(garnetcarmine/ruby/or

6、ange)。本部分的研究結(jié)果為篩選變異靶標(biāo)基因奠定了基礎(chǔ)。
　　3.眼色基因變異位點(diǎn)的篩進(jìn)
　　為了尋找導(dǎo)致褐飛虱復(fù)眼眼色變異的分子機(jī)理，即突變位點(diǎn)，本研究對(duì)野生型和突變型近等基因系的10個(gè)眼色相關(guān)基因的編碼區(qū)分別進(jìn)行了克隆和對(duì)比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有紅眼突變個(gè)體的犬尿氨酸羥化酶(KMO)編碼基因Nlkmo都存在三個(gè)同義突變位點(diǎn)、一個(gè)異義突變位點(diǎn)(L49I)和一個(gè)5堿基的插入突變位點(diǎn)。閱讀框內(nèi)5堿基的插入，使氨基酸翻譯提前終止，

7、缺少了115個(gè)氨基酸殘基，破壞了兩個(gè)跨膜螺旋。
　　4.Nlkmo基因的眼色決定作用驗(yàn)證
　　前人已證明，KMO在雙翅目的果蠅和蚊子、鱗翅目的家蠶復(fù)眼著色過(guò)程中起關(guān)鍵作用，但其對(duì)半翅目昆蟲(chóng)復(fù)眼著色過(guò)程的影響還不明確。本章對(duì)褐飛虱野生型品系3齡若蟲(chóng)注射KMO雙鏈RNA(dsKMO)后，Nlkmo表達(dá)水平顯著下降，復(fù)眼眼色部分變?yōu)榧t色，且眼黃素也下降為對(duì)照個(gè)體的55.3％。這表明，同其他昆蟲(chóng)一樣，褐飛虱KMO也是褐飛虱眼黃素合成

8、通路關(guān)鍵酶之一。此結(jié)果還說(shuō)明，Nlkmo作為標(biāo)記基因可用于褐飛虱及相近昆蟲(chóng)的卵期RNAi技術(shù)的研發(fā)。
　　5.Nlkmo基因的時(shí)空表達(dá)特征及其在突變體中的表達(dá)變化
　　為了深入了解褐飛虱Nlkmo基因的分子特性，本部分測(cè)定了其時(shí)空表達(dá)特征，并對(duì)比分析了其在紅眼突變體中的表達(dá)變化。Nlkmo基因在所有生育期及組織內(nèi)都有表達(dá)，包括卵、若蟲(chóng)、成蟲(chóng)、卵巢、中腸、馬氏管、體壁和脂肪體。Nlkmo轉(zhuǎn)錄本水平在NIL-BB和NIL-rr兩

9、品系間并無(wú)顯著差異，推斷Nlkmo存在的一個(gè)異義突變位點(diǎn)和一個(gè)5nt的插入位點(diǎn)并不影響轉(zhuǎn)錄本水平，可能是在蛋白質(zhì)翻譯及修飾階段對(duì)眼色產(chǎn)生影響。
　　6.Nlkmo編碼蛋白的催化活性分析
　　本章首先提取NIL-BB和NIL-rr兩品系褐飛虱頭部的總蛋白，分別命名為KMO-BB和KMO-rr。利用液相色譜技術(shù)測(cè)定了兩種總蛋白轉(zhuǎn)化犬尿氨酸(KYN)為3-羥基犬尿氨酸(3-HK)的催化活性。結(jié)果表明，KMO-BB的催化活性約為KM

10、O-rr的9.03倍。為了精準(zhǔn)分析，本章利用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)野生型和突變型KMO酶進(jìn)行了外源表達(dá)，分別命名為rKMO-BB和rKMO-rr,其中rKMO-rr未引入點(diǎn)突變位點(diǎn)(L49I)，只引入了5堿基的插入突變位點(diǎn)。利用相同方法測(cè)定重組蛋白的催化活性，結(jié)果表明，rKMO-BB的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于KMO-BB，而rKMO-rr的活性小于KMO-rr,以致未能檢測(cè)到。以上結(jié)果說(shuō)明，Nlkmo既是褐飛虱紅眼突變表型產(chǎn)生的靶標(biāo)基因，而5堿基的