腎透明細(xì)胞癌分子靶向治療中Sunitinib誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和Klotho抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制研究.pdf

1、腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)簡(jiǎn)稱腎癌，是起源于腎小管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，約占成人腎惡性腫瘤的90％。組織學(xué)上，腎癌表現(xiàn)為一系列具有獨(dú)特的形態(tài)和遺傳特征的亞型。腎透明細(xì)胞癌（clear-cell renal cell carcinoma，CCRCC）是其中最常見的類型，起源于近曲小管上皮，占腎癌的70～80％。腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展與VHL（von Hippel-Lindau）抑癌基因缺陷相關(guān)。pVHL突變

2、導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子-α(hypoxia-inducible factor，HIF-α)穩(wěn)定性增加。HIF-α進(jìn)入核內(nèi)與HIF-β形成復(fù)合物轉(zhuǎn)錄激活一系列缺氧相關(guān)基因，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成(VEGF，EPO)，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)(TGF-α，PDGF-β，Cyclin D)和糖代謝(GLUT1)。從而，為針對(duì)VHL通路的靶向治療提供了強(qiáng)有力的理論依據(jù)。
　　舒尼替尼(Sunitinib，SU011248)是靶向VHL通路的一種小分子多靶點(diǎn)受

3、體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)抑制劑。已有研究表明舒尼替尼的主要作用靶點(diǎn)是表達(dá)在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)等，在抑制腫瘤血管形成過程中起重要作用。隨著舒尼替尼廣泛用于晚期腎癌的治療，其發(fā)揮治療效用及最終發(fā)生耐藥的功能意義、分子機(jī)制亟待闡明，以克服耐藥、鞏固療效，更好進(jìn)行個(gè)

4、體化靶向治療。本研究第一部分圍繞舒尼替尼治療作用及其潛在機(jī)制展開。
　　雖然VHL通路的分子靶向治療取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，一定程度上延長(zhǎng)了患者的生存時(shí)間，但總有效率僅為20～30％，并且存在治療期間病情繼續(xù)進(jìn)展，不良反應(yīng)明顯等缺陷。因此，更深入地對(duì)腎癌病理學(xué)及分子生物學(xué)進(jìn)行研究，有助于改進(jìn)現(xiàn)有治療手段并探索新的、行之有效的治療靶點(diǎn)。Klotho作為特異性表達(dá)在腎小管上皮的抗衰老蛋白，主要參與調(diào)節(jié)鈣磷代謝和能量代謝。盡管近年來Kloth

5、o作為腫瘤抑制基因的作用引起諸多關(guān)注，但對(duì)于Klotho在腎癌發(fā)生中的作用及其機(jī)制目前尚不明確。本研究主要圍繞Klotho在腎癌中的作用及潛在的分子機(jī)制展開。
　　在本研究的第一部分，多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑舒尼替尼已被用作轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌(metastatic renal cell carcinoma，mRCC)治療的一線藥物，但其發(fā)揮治療效用的具體分子機(jī)制和功能效應(yīng)仍不清楚。我們目前的研究發(fā)現(xiàn)舒尼替尼處理后的腎癌細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的衰

6、老特征，包括衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性增強(qiáng)，衰老的分子標(biāo)志DcR2、Dec1表達(dá)增加，以及出現(xiàn)衰老相關(guān)的分泌表型(SASP)，如促炎癥細(xì)胞因子白介素-1α（IL-1α），白介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)的分泌增加。同時(shí)舒尼替尼可以抑制腎癌細(xì)胞的增殖，G1-S期的細(xì)胞周期阻滯和DNA損傷反應(yīng)，進(jìn)一步證明舒尼替尼誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞衰老的治療意義。機(jī)制研究表明舒尼替尼產(chǎn)生的治療誘導(dǎo)衰老(therapy-induce

7、d senescence，TIS)效應(yīng)主要?dú)w因于其對(duì)Raf-1/NF-κB抑制所導(dǎo)致p53/Dec1信號(hào)通路活化。進(jìn)一步應(yīng)用裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)了舒尼替尼治療后可以顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)及延長(zhǎng)總生存期，并伴隨著腫瘤組織p53、Dec1蛋白水平和SA-β-gal活性上調(diào)，Raf-1、Ki67蛋白水平下調(diào)。最后在接受舒尼替尼新輔助治療腎癌患者腫瘤組織樣本中驗(yàn)證了類似的現(xiàn)象。結(jié)論:這部分研究闡述了舒尼替尼發(fā)揮治療效用可能是由于通過抑制Raf-1/

8、NF-κB活性導(dǎo)致p53/Dec1信號(hào)通路活化，最終產(chǎn)生治療誘導(dǎo)衰老效應(yīng)。
　　在本研究的第二部分，Klotho是特異性表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞的抗衰老蛋白。已有研究表明Klotho在多種腫瘤中都發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用，但在腎癌中潛在作用和分子機(jī)制還有待闡明。瘤內(nèi)Klotho高表達(dá)與腫瘤大小，TNM分期和核分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，Klotho高表達(dá)還預(yù)示著腎癌病人較好的預(yù)后。高表達(dá)Klotho的RCC患者的總生存率顯著高于低表達(dá)的患者。在腎癌細(xì)

9、胞中過表達(dá)Klotho可使腫瘤細(xì)胞形態(tài)從間質(zhì)型轉(zhuǎn)化為上皮型、上皮細(xì)胞標(biāo)志分子(如E-cadherin)上調(diào)、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子(如N-cadherin、vimentin)下調(diào)，提示Klotho表達(dá)可誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)—上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymal-epithe lial transition，MET）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)Klotho介導(dǎo)的這種功能并不依賴于其特有的α-2，6唾液酸酶活性。此外，過Klotho表達(dá)通過抑制PI3K/Ak

10、t/GSK3β信號(hào)通路下調(diào)Snail蛋白水平，反之敲除Klotho可以上調(diào)Snail蛋白水平。PI3K/Akt信號(hào)通路的特異性抑制劑LY294002，GSK3β的特異性抑制劑LiC1可以分別重現(xiàn)過表達(dá)和敲除Klotho對(duì)Snail蛋白水平的影響。最后通過體外細(xì)胞劃痕試驗(yàn)，Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Collagen細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，在體外細(xì)胞培養(yǎng)中過表達(dá)Klotho抑制腎癌細(xì)胞的細(xì)胞遷移(cellmigration)和細(xì)胞侵襲(