TGF-β1誘導(dǎo)膽囊癌EMT過程中差異表達(dá)基因分析及NT5E和FcGBP的臨床病理意義探討.pdf

1、第一部分TGF-β1誘導(dǎo)膽囊癌EMT發(fā)生中差異表達(dá)基因分析
　　 目的：
　　 為研究膽囊癌侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制，我們利用TGF-β1誘導(dǎo)膽囊癌GBC-SD細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，然后應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)GBC-SD細(xì)胞與發(fā)生EMT的GBC-SD細(xì)胞的基因，分析其差異表達(dá)的基因。
　　 方法：
　　 使用5 ng/ml的TGF-β1誘導(dǎo)膽囊癌GBC-SD細(xì)胞株，分別提取該組和未經(jīng)誘導(dǎo)的膽囊癌GBC

2、-SD細(xì)胞株組的總RNA，純化后再進(jìn)行熒光標(biāo)記、對(duì)寡核苷酸芯片進(jìn)行雜交，激光掃描儀對(duì)其進(jìn)行掃描，根據(jù)熒光強(qiáng)度來(lái)篩選出兩者之間的差異基因，然后進(jìn)行在線生物信息學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 基因芯片實(shí)驗(yàn)共篩選出264個(gè)在膽囊癌GBC-SD細(xì)胞和經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后膽囊癌GBC-SD細(xì)胞間表達(dá)差異的基因。166個(gè)基因在經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后膽囊癌GBC-SD細(xì)胞組中表達(dá)上調(diào)，98個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，經(jīng)基因功能分類注釋系統(tǒng)查詢(GO分

3、類)，他們涉及到細(xì)胞粘附、細(xì)胞周期等;信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)他們涉及到細(xì)胞周期蛋白調(diào)節(jié)、磷酸肌醇介導(dǎo)的信號(hào)通路等。
　　 結(jié)論：
　　 我們利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)膽囊癌GBC-SD細(xì)胞及TGF-β1誘導(dǎo)發(fā)生EMT后的膽囊癌GBC-SD細(xì)胞差異表達(dá)的基因。結(jié)合文獻(xiàn)檢索分析我們認(rèn)為NT5E和FcGBP可能涉及到膽囊癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程，因此將這兩個(gè)基因作為下一步深入研究的目標(biāo)。
　　 第二部分NT5E和FcGBP基因及其蛋白在膽

4、囊癌組織中的表達(dá)及意義
　　 目的：
　　 通過檢測(cè)膽囊腺癌及慢性膽囊炎組織中NT5E和FcGBP的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，驗(yàn)證第一部分基因芯片的結(jié)果，并探討這兩個(gè)蛋白與膽囊癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　 方法：
　　 隨機(jī)收取了15例未行放化療患者的膽囊腺癌標(biāo)本和15例慢性結(jié)石性膽囊炎患者的慢性膽囊炎標(biāo)本，獲取其總RNA和總蛋白。NT5E和FcGBP的mRNA表達(dá)水平采用定量RT-PCR檢測(cè);NT5E和FcG

5、BP的蛋白質(zhì)表達(dá)水平采用Western-blot檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過定量RT-PCR分析顯示，膽囊腺癌NT5E mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，與慢性膽囊炎比較有高度顯著差異（1.012±0.019 vs0.225±0.021，P＜0.01）;而FcGBP mRNA在膽囊腺癌中的表達(dá)則與此相反，為明顯下調(diào)且有高度顯著差異(0.078±0.020 vs0.321±0.017，P＜0.01)。
　　 2.通過

6、Western-blot分析發(fā)現(xiàn)NT5E蛋白在膽囊腺癌中的表達(dá)有明顯上調(diào)，與慢性膽囊炎比較有高度顯著差異（0.826±0.011 vs0.412±0.017，P＜0.01）;而FcGBP蛋白在膽囊腺癌中的表達(dá)有明顯下調(diào)，與慢性膽囊炎比較有高度顯著差異(0.084±0.017 vs0.187±0.025， P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 膽囊腺癌中的NT5E mRNA以及其蛋白較慢性膽囊炎中的明顯高表達(dá)，而FcGBP

7、 mRNA則相反，為低表達(dá)，這正與前述基因芯片結(jié)果相符合:NT5E、FcGBP基因可能從兩個(gè)相反的方面涉及膽囊癌EMT調(diào)節(jié)，進(jìn)而與膽囊癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　 第三部分膽囊良惡性病變組織中NT5E和FcGBP的表達(dá)及其臨床病理意義
　　 目的：
　　 檢測(cè)膽囊腺癌及其癌旁組織、腺瘤、息肉和慢性膽囊炎標(biāo)本中NT5E和FcGBP的表達(dá)，探討其在膽囊良惡性病變中的臨床病理意義以及與膽囊腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　

8、方法：
　　 共收集到了108例膽囊腺癌、46例癌旁組織、30例腺瘤、15例息肉和35例慢性膽囊炎組織標(biāo)本切片，采用EnVision免疫組化二步法對(duì)NT5E和FcGBP進(jìn)行染色，整理數(shù)據(jù)后利用SPSS軟件分析。
　　 結(jié)果：
　　 (1)108例膽囊腺癌中NT5E陽(yáng)性表達(dá)為59例(54.6％)，46例癌旁組織中14例陽(yáng)性(30.4％)，30例腺瘤中5例陽(yáng)性(16.7％)，15例息肉中2例陽(yáng)性(13.3％)，35例

9、慢性膽囊炎膽囊上皮中4例陽(yáng)性(11.4％):膽囊腺癌中NT5E表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織、腺瘤、息肉和慢性膽囊炎膽囊上皮，差異均有高度顯著性(P＜0.01);另一方面108例膽囊腺癌中FcGBP陽(yáng)性表達(dá)為52例(48.1％)，46例癌旁組織中中陽(yáng)性為35例(76.1％)，30例腺瘤中陽(yáng)性為24例(80.0％)，15例息肉中陽(yáng)性為13例(86.7％)，35例慢性膽囊炎膽囊上皮中陽(yáng)性為30例(85.7％)，F(xiàn)cGBP在膽囊腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率

10、明顯低于其在癌旁組織、腺瘤、息肉和慢性膽囊炎膽囊上皮中的陽(yáng)性表達(dá)率，并有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。此外，良性病變的膽囊上皮不論NT5E陽(yáng)性表達(dá)、FcGBP陰性表達(dá)，光鏡下均可見呈不同程度不典型增生。
　　 (2) NT5E在高分化的腺癌、最大直徑＜2cm的腫塊以及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)周圍組織侵犯的病例中，其陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于其在低分化的腺癌、最大直徑≥2cm腫塊以及發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和周圍組織浸潤(rùn)的病例的陽(yáng)性表達(dá)率(P＜

11、0.05或P＜0.01);但FcGBP在上述組織中的表達(dá)陽(yáng)性率結(jié)果與NT5E相反(P＜0.05或P＜0.01);
　　 (3)采用Kaplan-Meier單因素生存分析，發(fā)現(xiàn)膽囊癌患者術(shù)后的平均生存期與其病理類型、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫塊最大直徑、周圍組織侵犯的狀況等均有密切關(guān)系(P＜0.05或P＜0.01);NT5E表達(dá)陽(yáng)性的患者術(shù)后生存期明顯低于陰性表達(dá)的患者（P＜0.05），而FcGBP陽(yáng)性表達(dá)的患者則生存期明顯長(zhǎng)于其陰性表達(dá)

12、的患者(P＜0.05)。NT5E陽(yáng)性表達(dá)、FcGBP陰性表達(dá)患者的生存時(shí)間顯著少于NT5E陰性表達(dá)、FcGBP陽(yáng)性表達(dá)患者(P＜0.01); Cox回歸多因素分析也表明NT5E表達(dá)陽(yáng)性(P=0.019)或FcGBP表達(dá)陰性(P=0.004)均是膽囊腺癌預(yù)后不良的評(píng)價(jià)指標(biāo)。
　　 結(jié)論：
　　 NT5E及FcGBP表達(dá)水平均為反映膽囊癌發(fā)生、進(jìn)展以及臨床生物學(xué)行為的重要指標(biāo);NT5E陽(yáng)性表達(dá)者和（或）FcGBP陰性表達(dá)者預(yù)