小檗堿抑制高脂誘導(dǎo)的大鼠代謝性內(nèi)毒素血癥及其機(jī)制的研究.pdf

1、[研究目的]
　　 隨著生活水平的提高，肥胖已成為威脅人類健康的重要疾病。肥胖產(chǎn)生一系列健康問(wèn)題，如高血壓病，2型糖尿病，心血管疾病，非酒精性脂肪肝等。生活方式干預(yù)往往難以堅(jiān)持，藥物治療的療效與安全性受到很大的質(zhì)疑，手術(shù)治療的適應(yīng)證也比較狹窄，這些都增加了肥胖的治療難度。
　　 小檗堿是存在于黃連、黃柏等藥材中的主要生物堿，臨床上長(zhǎng)期用于抗腸道細(xì)菌感染，近年來(lái)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí)，小檗堿能安全、有效地降脂、降糖、減輕體

2、重，但其作用機(jī)制還并不十分明確。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿生物利用度很低，基本不被吸收入血。因此，我們認(rèn)為小檗堿可能主要針對(duì)靶器官-腸道發(fā)揮作用。
　　 研究已經(jīng)證實(shí)，腸道內(nèi)革蘭陰性桿菌溶解釋放的脂多糖入血會(huì)引起代謝性內(nèi)毒素血癥，通過(guò)激活全身性慢性低度炎癥系統(tǒng)，從而導(dǎo)致肥胖和胰島素抵抗等。腸黏膜屏障損傷，也會(huì)造成腸道細(xì)菌的移位，形成內(nèi)毒素血癥。此外，胃腸道激素對(duì)人體的能量代謝平衡也發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)小檗堿能促進(jìn)糖尿病大鼠腸道GL

3、P-1分泌增加。
　　 本研究的目的是檢測(cè)大鼠門靜脈內(nèi)毒素水平和系統(tǒng)性炎癥水平，觀察緊密連接蛋白分布和表達(dá)的變化，檢測(cè)胃腸道激素分泌水平的變化，探討小檗堿治療對(duì)代謝性內(nèi)毒素血癥的保護(hù)作用，同時(shí)探討其相關(guān)的腸道菌群結(jié)構(gòu)、腸屏障功能、腸道激素分泌等改變對(duì)改善內(nèi)毒素血癥的影響，為臨床治療肥胖和胰島素抵抗等相關(guān)疾病提供新的治療策略和依據(jù)。
　　 [研究方法]
　　 SD大鼠30只，隨機(jī)分成兩組:高脂喂養(yǎng)組(HF，n=20

4、)和低脂喂養(yǎng)組(LF，n=10)，14周喂養(yǎng)結(jié)束時(shí)，以HF組大鼠的體重顯著高于LF組為大鼠肥胖模型建造成功。
　　 再將高脂喂養(yǎng)的20只大鼠按體重的隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為2組:高脂組(HF)和小檗堿治療組(HB)。LF組繼續(xù)低脂喂養(yǎng)，HF組繼續(xù)高脂喂養(yǎng)，HB組在高脂喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上每天給予小檗堿150mg/kg體重灌胃。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每隔一天監(jiān)測(cè)1次各組動(dòng)物的進(jìn)食、進(jìn)水量，每周監(jiān)測(cè)1次體重變化情況，小檗堿共干預(yù)6周。
　　 小檗堿治療

5、6周后，大鼠禁食12小時(shí)，用3％戊巴比妥鈉(30mg/Kg)腹腔注射麻醉，肝門靜脈取血，用動(dòng)態(tài)比濁法檢測(cè)內(nèi)毒素，用Luminex液相芯片技術(shù)檢測(cè)大鼠門靜脈總GIP、Glucagon、PP、PYY的水平，ELISA技術(shù)檢測(cè)總GLP-1和GLP-2的水平;眼球后內(nèi)眥靜脈取血，用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血糖、血脂、肝功，ELISA技術(shù)檢測(cè)胰島素。
　　 血取凈后，取內(nèi)臟以及腹部皮下脂肪，濾紙吸干，稱重，部分用RT-PCR法檢測(cè)炎性因子、氧化應(yīng)

6、激因子和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)標(biāo)志物的表達(dá)，部分于4％多聚甲醛中固定用于HE染色。取部分肝臟，部分用RT-PCR法檢測(cè)肝臟炎性因子、氧化應(yīng)激因子和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)標(biāo)志物的表達(dá)，部分于4％多聚甲醛中固定用于油紅O染色。取近端結(jié)腸組織，RT-PCR法檢測(cè)結(jié)腸緊密連接蛋白和胰高血糖素原的表達(dá)，免疫熒光技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸黏膜表面claudin-1和claudin-2的表達(dá)、分布以及結(jié)腸L細(xì)胞數(shù)量。收集大鼠盲腸內(nèi)新鮮糞便，用焦磷酸測(cè)序分析腸道菌群的變化。
　　

7、 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，測(cè)量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one way ANOVA)，組間比較，方差經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)，齊性檢驗(yàn)采用Test of Homogeneity of Variances，如果方差齊用LSD檢驗(yàn)，如果方差不齊用非參數(shù)檢驗(yàn)的Tamhane's T2法。p＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 1.高脂飼

8、料喂養(yǎng)14周成功建立肥胖大鼠模型
　　 14周結(jié)束時(shí)，高脂喂養(yǎng)組大鼠的體重顯著大于低脂喂養(yǎng)組。
　　 2.小檗堿對(duì)肥胖大鼠體重和代謝的影響
　　 經(jīng)過(guò)小檗堿6周的干預(yù)，肥胖組大鼠體重增加顯著減少，內(nèi)臟和皮下脂肪的重量均顯著減小，進(jìn)食量有下降趨勢(shì)。小檗堿治療使高脂喂養(yǎng)大鼠的空腹血糖和胰島素顯著降低，膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、游離脂肪酸均顯著降低，高密度脂蛋白顯著升高，肝谷丙轉(zhuǎn)氨酶也顯著降低，甘油三酯有下降趨勢(shì)但無(wú)

9、顯著差異。
　　 小檗堿治療使肥胖大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度顯著減輕，肝臟膽固醇含量顯著下降，甘油三酯含量有下降趨勢(shì)但無(wú)顯著差異，使肥胖大鼠單個(gè)脂肪細(xì)胞的面積顯著減小。
　　 3.小檗堿改善代謝性內(nèi)毒素血癥
　　 小檗堿干預(yù)6周后，肥胖大鼠門靜脈中內(nèi)毒素水平顯著降低。小檗堿治療使肥胖大鼠肝臟中IL-1β、NADPHox、CD68、TLR4、LBP mRNA的表達(dá)均顯著降低，使MIF mRNA的表達(dá)有增加趨勢(shì)但無(wú)顯著差

10、異。小檗堿治療使肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪中IL-1β、PAI-1、STAMP2、NADPHox、MCP-1、F4/80 mRNA的表達(dá)均顯著降低，使TNF-α mRNA有降低趨勢(shì)但無(wú)顯著差異。
　　 4.小檗堿改善結(jié)腸腸道屏障功能，降低腸道通透性
　　 小檗堿干預(yù)6周后，肥胖大鼠尾靜脈血漿的FITC-dextran曲線下面積顯著減小，近端結(jié)腸中緊密連接蛋白claudin-1、ZO-1mRNA的表達(dá)水平均顯著增加，MLCKmRNA

11、的表達(dá)顯著減少，而occludin mRNA的表達(dá)有增加趨勢(shì)，claudin-2 mRNA的表達(dá)基本沒(méi)有變化。免疫熒光顯示，小檗堿能抑制肥胖大鼠腸道claudin-1蛋白表達(dá)的下降，對(duì)claudin-2蛋白的表達(dá)沒(méi)什么影響，但小檗堿能抑制claudin-2蛋白從黏膜表面向隱窩移位。
　　 5.小檗堿改善胃腸激素的分泌，促進(jìn)L細(xì)胞增殖
　　 小檗堿干預(yù)6周使肥胖大鼠門靜脈中胃腸激素總GLP-1、GLP-2、PYY的水平均顯

12、著增加，總GIP和PP的水平均顯著下降，glucagon有下降趨勢(shì)。小檗堿還能顯著增加肥胖大鼠近端結(jié)腸中的L細(xì)胞數(shù)量，使結(jié)腸proglucagon mRNA的表達(dá)顯著增加。
　　 6.小檗堿調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)
　　 小檗堿治療使肥胖大鼠腸道菌群的多樣性和菌群豐度顯著減少，共有55種菌屬受到小檗堿顯著影響。其中硬壁菌門中Coprococcus、Lachnospiraceae、Roseburia、Ruminococcus、Fa

13、ecalibacterium屬的豐度均顯著減少，變形菌門中的脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)豐度也顯著降低。
　　 [結(jié)論]
　　 1.小檗堿灌胃能對(duì)肥胖大鼠起到減輕體重，改善糖耐量，調(diào)節(jié)血脂的作用，還能改善大鼠的肝功。
　　 2.小檗堿能通過(guò)改善代謝性內(nèi)毒素血癥水平，改善肝臟和內(nèi)臟脂肪組織的炎癥和氧化應(yīng)激水平，減輕系統(tǒng)性炎癥，從而達(dá)到減輕體重和改善胰島素抵抗的作用。
　　 3.小檗堿能改善緊密連

14、接蛋白的表達(dá)和分布，從而改善腸道屏障功能，降低腸道通透性，減少腸源性內(nèi)毒素血癥。
　　 4.小檗堿能改善胃腸激素的分泌，促進(jìn)結(jié)腸L細(xì)胞增殖，促進(jìn)結(jié)腸胰高血糖素原的表達(dá)。
　　 5.小檗堿使球形梭菌和柔嫩梭菌亞群中產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌屬的豐度減少，產(chǎn)丁酸鹽菌屬能夠降解植物多糖為宿主提供額外能量。變形菌門中Desulfovibrio屬在腸道中能夠?qū)⒘蛩猁}還原為硫化物，硫化物對(duì)腸道上皮細(xì)胞具有毒性作用。小檗堿對(duì)肥胖大鼠的體重和胰島素抵