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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:觀察高糖對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞(glomerularmesangialcell,GMC)細(xì)胞大小及其細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)成分分泌的變化,及其對(duì)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白(CellCycleRegulatoryProteins,CCRP)表達(dá)及其細(xì)胞周期時(shí)相分布的影響。并探討從冬蟲(chóng)夏草蟲(chóng)草菌絲中提取的具有免疫抑制活性的物質(zhì)--多球殼
2、菌素(myriocin,ISP-1)的干預(yù)效應(yīng)。 方法:參照Fujita及Kluepfel等方法,采用經(jīng)典的液相色譜法及有機(jī)溶劑反復(fù)萃取的方式,從人工冬蟲(chóng)夏草蟲(chóng)草菌絲中提取ISP-1。利用體外培養(yǎng)大鼠GMC,予以高糖(450mg/dlD-glucose,HG)制造GMC細(xì)胞肥大模型,同時(shí)以正常糖(100mg/dlD-glucose,NG)組及高滲(350mg/dlD-mannitol+100mg/dlD-glucose,MN)組
3、作為對(duì)照,并以HG加ISP-1(450mg/dlD-glucose+100ug/mlISP-1,ISP-1)作為干預(yù)組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞大小(以前向角散射光平均強(qiáng)度表示細(xì)胞大小)、細(xì)胞周期分布及CyclinD1的表達(dá)。GMC中其它CCRP如p21cipl、P27kipl及CyclinE的表達(dá)采用Western印跡法檢測(cè)。以ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的纖維連接蛋白(FN)、Ⅳ型膠原(ColⅣ)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、透明質(zhì)酸(
4、HA)及層粘連蛋白(LN)等ECM的含量,采用細(xì)胞免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)GMC細(xì)胞內(nèi)α-SMA的表達(dá)。 結(jié)果:高糖組GMC細(xì)胞體積較正常糖組及高滲組明顯增大(P<0.05),而高滲組與正常糖組相比較無(wú)顯著性差異(P>0.05),由此可知高糖可導(dǎo)致GMC肥大;正常糖組有一定的CyclinD1、CyclinE、p21cipl、P27kipl及α-SMA表達(dá)和ECM的分泌,而高糖組CCRP、α-SMA表達(dá)及ECM分泌明顯增加,且隨時(shí)間
5、的延長(zhǎng)更加明顯,72h達(dá)高峰。此外細(xì)胞周期分析提示高糖可使GMC停滯于G1期,高糖組G1期細(xì)胞比例較正常糖組明顯增高(P<0.05)。而加入ISP-1后可以明顯改善GMC的肥大、細(xì)胞周期停滯和CCRP表達(dá),同時(shí)可使ECM分泌和α-SMA的表達(dá)顯著減少。而ISP-1組的GMC細(xì)胞大小、CCRP和α-SMA的表達(dá)以及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌的表達(dá)與正常糖組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論:高糖導(dǎo)致GMC發(fā)生雙向生長(zhǎng)反應(yīng),即細(xì)胞先進(jìn)行
6、自限性增生,后便停止在G1末期發(fā)生肥大,并且導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)表達(dá)增加。CyclinD1和CyclinE表達(dá)增加導(dǎo)致GMC細(xì)胞增生,而p21cipl、P27kipl表達(dá)的上調(diào)在GMC細(xì)胞肥大和細(xì)胞周期停頓中起重要作用。同時(shí)高糖導(dǎo)致GMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,即α-SMA表達(dá)增高與腎纖維化密切相關(guān)。ISP-1可能通過(guò)改善CCRP、α-SMA的表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)的異常分泌及細(xì)胞周期停滯,從而抑制GMC的肥大、細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及ECM分泌。由此推測(cè)I
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