非血管化游離骨移植及同期種植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、非血管化游離骨移植（NVBG）的出現(xiàn)為眾多頜骨缺損的患者帶來(lái)了福音，直至目前這一技術(shù)仍是最常用的頜骨修復(fù)手段之一。對(duì)于NVBG的愈合過(guò)程，傳統(tǒng)的“爬行替代”理論認(rèn)為移植骨終將吸收，被新生骨組織所逐漸替代。在這一理論的指導(dǎo)下，NVBG同期種植過(guò)去一直被視為禁忌。本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究的基礎(chǔ)上分別用犬和轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建NVBG植骨模型，以移植骨轉(zhuǎn)歸、新骨生成、血供重建、種植體骨結(jié)合為研究重點(diǎn)，試圖全面反映移植骨愈合全貌；探討新生骨的來(lái)源和促進(jìn)

2、種植體骨結(jié)合的因素，為NVBG及同期種植的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)部分。
　　第一部分構(gòu)建犬下頜骨缺損游離髂骨移植的動(dòng)物模型，并以此為基礎(chǔ)，對(duì)移植骨的細(xì)胞活力、成骨方式、血供重建、VEGF和TGF-β1表達(dá)作一深入研究，探討NVBG移植骨的愈合規(guī)律和促進(jìn)因素。
　　實(shí)驗(yàn)方法：選用實(shí)驗(yàn)犬12只（術(shù)前1個(gè)月拔除雙側(cè)下頜前磨牙），選取一側(cè)下頜骨造成2.5cm全層骨缺損，植入同樣大小的全層自體髂骨，重建

3、鈦板固定。髂骨塊離體時(shí)間控制在20min以內(nèi)。術(shù)后1、2、4個(gè)月取材，行大體、X線、下齒槽動(dòng)脈造影、組織學(xué)、墨汁灌注微血管計(jì)數(shù)、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)、TGF-β1原位雜交、VEGF和TGF-β1免疫組織化學(xué)觀察。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：X線觀察表明移植骨區(qū)呈現(xiàn)漸進(jìn)性的骨修復(fù)和改建的過(guò)程。術(shù)后1個(gè)月：移植骨塊密度不均，近牙槽嵴頂處有少量吸收，交界區(qū)呈不規(guī)則透光影。術(shù)后2個(gè)月：移植骨較1個(gè)月前密度有所增加，但仍低于周邊頜骨；交界區(qū)仍有部分透光影。

4、術(shù)后4個(gè)月：植骨區(qū)形態(tài)不規(guī)則，密度明顯高于周圍頜骨；移植骨與宿主骨已形成完整連接。動(dòng)脈造影發(fā)現(xiàn)下齒槽動(dòng)脈中斷，動(dòng)脈末端可見(jiàn)細(xì)小分支發(fā)出。
　　組織學(xué)觀察顯示術(shù)后1個(gè)月：移植骨表層骨質(zhì)大部分已被吸收，新骨生成以微血管為中心展開(kāi)；骨膜下大量未分化間充質(zhì)細(xì)胞聚集，可見(jiàn)軟骨細(xì)胞團(tuán)塊。術(shù)后2個(gè)月：移植骨進(jìn)一步吸收，仍可見(jiàn)到正常骨細(xì)胞形態(tài)。新生骨小梁粗大融合，連接成片，部分已礦化成熟，微血管數(shù)目較多。術(shù)后4個(gè)月：新生骨、移植骨與宿主骨已基本融

5、為一體，新的骨髓腔開(kāi)始形成，血管數(shù)量減少。
　　對(duì)移植骨陷窩的著色計(jì)數(shù)表明，術(shù)后1個(gè)月，移植骨有近30％骨細(xì)胞存活，2個(gè)月存活率接近20％。移植骨術(shù)后1～2個(gè)月邊緣部位的骨礦化沉積率明顯高于中間部位，也高于周圍頜骨近2倍；術(shù)后4個(gè)月移植骨各部位礦化速率與正常骨質(zhì)無(wú)明顯差異。對(duì)礦化骨小梁相關(guān)參數(shù)（TV/BV、Tb.Th和Tb.Sp）、未礦化骨基質(zhì)相關(guān)參數(shù)(OS/BS、O.Th）和骨吸收參數(shù)（N.Oc/BS、ES/BS）的形態(tài)計(jì)量學(xué)分

6、析結(jié)果表明：術(shù)后1～2個(gè)月移植骨不同部位間上述3組參數(shù)均有明顯差異。邊緣部位在骨和骨基質(zhì)的生成方面明顯高于中間區(qū)域；而在骨吸收指標(biāo)上低于中間區(qū)域。術(shù)后4個(gè)月不同部位間的成骨差異縮小，接近正常水平。從同一部位各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的比較來(lái)看，無(wú)論是移植骨邊緣還是中部，3組參數(shù)均有明顯差異。微血管計(jì)數(shù)分析，移植骨近中、遠(yuǎn)中部位各時(shí)間點(diǎn)微血管數(shù)目并無(wú)明顯差異，中部則處于明顯乏血管區(qū)域。術(shù)后1～2個(gè)月，近、遠(yuǎn)中部位微血管數(shù)目均較周圍頜骨顯著增多，2個(gè)月時(shí)血

7、管數(shù)量處于最高峰。而同期的中間部位血管數(shù)目則明顯少于周邊頜骨。術(shù)后4個(gè)月時(shí)各部位血管數(shù)目接近正常。結(jié)合血管和新生骨的計(jì)量分析結(jié)果，推測(cè)新生血管和新骨生成呈正相關(guān)關(guān)系，與骨吸收呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　VEGF免疫組化觀察發(fā)現(xiàn)VEGF定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞，其表達(dá)與微血管數(shù)量呈明顯量效關(guān)系。術(shù)后1～2個(gè)月，VEGF在血管內(nèi)皮細(xì)胞中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。術(shù)后4個(gè)月呈弱陽(yáng)性表達(dá)。原位雜交和免疫組化觀察發(fā)現(xiàn)TGF-β1在多種組織細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)。術(shù)后1個(gè)月，T

8、GF-β1在新生軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞內(nèi)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；術(shù)后2個(gè)月，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞內(nèi)TGF-β1仍呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；移植骨只有少部分有弱陽(yáng)性表達(dá)；術(shù)后4個(gè)月，新生骨細(xì)胞和基質(zhì)內(nèi)有陽(yáng)性表達(dá)。
　　上述結(jié)果表明不同時(shí)期NVBG移植骨塊均能保留部分活力，新骨在術(shù)后1個(gè)月開(kāi)始大量長(zhǎng)入，術(shù)后2個(gè)月進(jìn)一步生長(zhǎng)并持續(xù)礦化，術(shù)后4個(gè)月開(kāi)始成熟改建。新骨生長(zhǎng)以新生血管為中心展開(kāi)，新骨生成與新生血管有正相關(guān)性。VEGF和TGF-β1在血管再生和新

9、骨生成中發(fā)揮重要作用，二者之間有協(xié)同作用。
　　第二部分在前期游離植骨的基礎(chǔ)上，同期種植體植入。以種植體骨結(jié)合為著眼點(diǎn)，探討NVBG同期種植種植體骨界面和種植體周圍骨質(zhì)的生成和改建規(guī)律以及VEGF和TGF-β1在種植體骨結(jié)合中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法：選用實(shí)驗(yàn)犬24只，分為2組，術(shù)前1個(gè)月拔除兩側(cè)下頜前磨牙。如上述方法形成下頜骨缺損的游離髂骨修復(fù)，A組在髂骨塊的中部和側(cè)方分別植入1枚種植體。B組將種植體與rhVEGF165和r

10、hTGF-β1復(fù)合后再植入移植髂骨內(nèi)。犬的另一側(cè)下頜常規(guī)植入1枚種植體作為對(duì)照。術(shù)后1、2、4個(gè)月取材，行大體、X線、組織學(xué)、顯微CT觀察和種植體骨結(jié)合力測(cè)試。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：X線觀察術(shù)后1個(gè)月，種植體周圍有明顯透光影；術(shù)后2個(gè)月，種植體周圍骨質(zhì)有輕度阻射，密度低于周圍移植骨。術(shù)后4個(gè)月，種植體與周圍骨質(zhì)大部分形成直接結(jié)合，無(wú)透射間隙存在。從種植體骨結(jié)合形成時(shí)間來(lái)看，術(shù)后1個(gè)月，BIC不足5％，術(shù)后2個(gè)月為25％左右；而同時(shí)間對(duì)照

11、組的BIC分別為10％、35％。種植體骨界面的力學(xué)測(cè)試也證明術(shù)后1～2個(gè)月骨移植組較對(duì)照組差異明顯。術(shù)后4個(gè)月時(shí)，A、B兩組邊緣位置的BIC達(dá)到60％以上，種植體骨界面結(jié)合力接近220N，已形成較好的骨結(jié)合。M-CT骨形態(tài)計(jì)量分析表明術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)A、B兩組在TV/BV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N四組參數(shù)測(cè)量上均與對(duì)照組有明顯差異；邊緣部位在術(shù)后1、2、4個(gè)月的骨質(zhì)新生和改建速度明顯高于中間部位；從同一部位不同時(shí)間分析，骨小梁呈現(xiàn)出

12、從少到多的量和質(zhì)的累計(jì)過(guò)程，而對(duì)照組的這一進(jìn)程明顯快于A、B組。從種植體周圍骨質(zhì)密度變化來(lái)看，各時(shí)間點(diǎn)A、B組骨小梁組織礦化密度和連接密度均小于對(duì)照組。邊緣部位各時(shí)間點(diǎn)骨連接密度顯著高于中間部位。VEGF和TGF-β1同時(shí)用于種植體局部，結(jié)果表明術(shù)后1、2個(gè)月A組BIC較B組顯著增高；對(duì)種植體周圍骨小梁的進(jìn)一步分析表明，A組的成骨的作用較B組明顯增強(qiáng)。
　　上述試驗(yàn)結(jié)果表明NVBG同期種植體植入早期（術(shù)后1～2個(gè)月），種植體骨界面

13、以纖維連接為主，術(shù)后4個(gè)月，有效的種植體骨結(jié)合形成。邊緣部位BIC和成骨效率高于中間部位。TGF-β1和VEGF對(duì)種植體骨結(jié)合早期（術(shù)后1～2個(gè)月）有明顯的促進(jìn)作用。
　　第三部分利用GFP-C57BL/6小鼠建立NVBG動(dòng)物模型，以新生骨來(lái)源和移植骨的成骨能力為研究重點(diǎn)，通過(guò)觀察在不同時(shí)間點(diǎn)移植骨和新生骨細(xì)胞GFP表達(dá)，判斷移植骨活力和新生骨來(lái)源。
　　實(shí)驗(yàn)方法：1、取GFP-C57BL/6小鼠脛骨，作體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)，觀

14、察成骨細(xì)胞的繁殖能力和連續(xù)傳代對(duì)GFP表達(dá)的影響。2、取GFP-C57BL/6和C57BL/6小鼠各15只，切取GFP-C57BL/65mm脛骨，完整保留骨膜及部分肌肉附著，植入C57BL/6小鼠同法截骨后的骨缺損區(qū)。分別于術(shù)后3天、1、2、3、4周取材，行X線、組織學(xué)和熒光顯微鏡觀察。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：X線觀察術(shù)后3天～1周，移植骨與宿主骨間隙明顯，未見(jiàn)明顯移植骨吸收。術(shù)后2～3周，移植骨邊緣隱約可見(jiàn)膨隆的骨痂形成，植骨間隙模糊。

15、術(shù)后4周，移植骨與宿主形成明顯的條索樣骨性連接。組織學(xué)觀察術(shù)后3天移植骨區(qū)出血炎癥反應(yīng)明顯。術(shù)后1周移植骨表面進(jìn)一步吸收，破骨細(xì)胞大量增生；未分化間充質(zhì)細(xì)胞、成骨前體細(xì)胞聚集。術(shù)后2周移植區(qū)由外向內(nèi)可分為6個(gè)層次，依次為肌肉、骨膜、新生軟骨層、網(wǎng)狀骨小梁層、移植骨、移植骨骨髓腔。術(shù)后3周新生骨小梁粗大，部分與移植骨相融合。有早期的骨髓腔形成。術(shù)后4周新生骨小梁進(jìn)一步融合，外層已有早期板狀骨形成，內(nèi)層與余留移植骨融合不易區(qū)分。熒光顯微鏡觀

16、察術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)移植骨周圍的肌肉一直呈現(xiàn)亮綠色熒光；新生骨小梁周圍的成骨細(xì)胞也有明顯熒光表達(dá)。移植骨骨細(xì)胞內(nèi)有部分熒光表達(dá)。
　　上述結(jié)果表明GFP-C57BL/6小鼠成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)、傳代后，仍對(duì)GFP蛋白有穩(wěn)定表達(dá)。GFP-C57BL/6小鼠NVBG脛骨移植術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)移植骨、肌肉、新生成骨細(xì)胞均有GFP熒光表達(dá)，充分說(shuō)明在適宜的條件下NVBG移植骨并非完全經(jīng)歷“爬行替代”，移植骨自身有很強(qiáng)的成骨能力。移植骨膜在新骨生成中起重要