T細胞因子4在毛囊毛乳頭細胞中的表達及其功能研究.pdf

1、研究背景與目的: 位于毛囊基底部的特殊間質(zhì)成分毛乳頭細胞(dermalpapillacell，DPC)在毛囊發(fā)育和周期性再生調(diào)控中起主導作用。在胚胎期，DPC產(chǎn)生多種針對表皮的調(diào)節(jié)因子，促使表皮細胞增生分化形成毛囊。出生后毛囊的周期性再生過程中誘導上皮細胞增殖和分化的信號也來自DPC。誘導毛囊形成是DPC最為顯著的功能特征，DPC功能的異常變化是導致毛囊周期失衡和脫發(fā)現(xiàn)象的主要起始因素。因此對DPC生物學功能變化的調(diào)控機制進行深

2、入研究，對毛囊生物學和毛發(fā)疾病的研究都有重大的意義。相關研究先后鑒定出數(shù)十種與DPC相關的調(diào)控因子，這些調(diào)控因子在DPC和毛囊上皮細胞的相互作用中構成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，但尚不能確定其中具有關鍵作用的因子或調(diào)控途徑。 研究表明，細胞在不同的生物學功能狀態(tài)中表達的基因不同，基因表達的有序性、選擇性是細胞功能變化的內(nèi)在根據(jù)。因此，通過分析不同狀態(tài)下DPC基因表達的差異，可為揭示DPC生物學功能調(diào)控規(guī)律提供重要信息。獲取差異表達的基因?qū)⒂?/p>

3、助于了解DPC在生理和病理條件下功能變化的分子機制，為毛囊發(fā)育和毛囊周期性生長調(diào)控研究提供新的視野。 在以往的研究中，本課題組使用抑制性消減雜交技術(SSH)結合SMARTTMcDNA合成技術對人活體組織中休止期毛囊DPC及生長期毛囊DPCmRNA的表達差異進行了研究。SSH方法通過兩輪雜交和抑制性PCR，可對兩個樣本的基因表達進行有效對比。運用SMARTTMcDNA合成技術合成cDNA，使對活體組織毛乳頭標本進行基因表達差異研

4、究成為可能。最終我們成功建立了毛乳頭差異表達cDNA文庫，為進一步闡述DPC功能調(diào)控的分子機制奠定了基礎。 從所建立的毛乳頭差異表達cDNA文庫中，我們首次發(fā)現(xiàn)了Wnt信號通路關鍵信號分子T細胞因子4(Tcellfactor4,TCF4)作為生長期毛囊DPC的上調(diào)表達基因，并使用反向Northern實驗對該結果進行了驗證。TCF4在DPC中差異表達為首次發(fā)現(xiàn)，生物學意義尚不明了。本課題擬研究DPC在凝集性生長和非凝集性生長狀態(tài)下

5、的TCF4基因表達差異，以及對TCF4.基因在DPC生物學功能調(diào)控中的作用進行實驗研究。 方法與結果: 1.TCF4基因在毛囊DPC中的表達 首先應用原位雜交技術檢測斑禿患者和正常人頭皮組織的TCF4.基因的表達；應用細胞免疫熒光檢測凝集性生長和非凝集性生長的人DPC的TCF4蛋白的表達；RT-PCR的方法從上述兩種細胞的總RNA擴增TCF4基因。結果發(fā)現(xiàn)TCF4基因在正常頭皮組織毛囊DPC表達，而在斑禿組織毛囊

6、的。DPC不表達；TCF4基因在凝集性生長期DPC中表達，而在非凝集性生長期。DPC不表達。表明TCF4基因在生長期DPC中高水平表達。 2.pcDNA3.0-TCF4表達載體的構建及表達 為了研究TCF4基因?qū)PC增殖的影響，我們構建了pcDNA3.0-TCF4表達載體。首先從凝集性生長DPC中提取總RNA，RT-PCR獲得帶有酶切位點的TCF4基因克隆，亞克隆入pcDNA3.0載體中，并通過雙酶切和測序進行鑒定。利

7、用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染到DPC中進行穩(wěn)定表達，檢測轉(zhuǎn)染前后TCF4表達的變化。以未轉(zhuǎn)染的DPC作為對照組，分別用流式細胞儀檢測DPC細胞周期的變化，Westernblot檢測DPC的肝細胞生長因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)、干細胞生長因子(stemcellfactor，SCF)的表達，MTT比色法檢測細胞生長曲線，3H-TdR檢測細胞增殖。結果表明，我們從DPC中獲得TCF4基因克隆并且成功構建了真核表達載體

8、。經(jīng)過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，DPC中TCF4在mRNA和蛋白表達水平上調(diào)。與對照組相比，DPC的增殖能力和相關細胞因子的分泌能力得到明顯提高。結果表明，TCF4基因可以促進DPC增殖和分泌細胞因子的功能。 3.RNA干擾抑制TCF4表達對DPC生物學功能的影響 為了進一步探討TCF4的表達對DPC細胞生物學功能的影響，我們采用化學合成法合成3對TCF4siRNA，并轉(zhuǎn)染DPC。采用半定量RT-PCR及Westernblot分別從mR

9、NA和蛋白質(zhì)水平檢測DPCTCF4的表達情況。以未轉(zhuǎn)染siRNA的DPC作為對照組，用流式細胞儀檢測DPC細胞周期的變化，Westernblot檢測DPC的胰島素樣生長因子-1(insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1)和SCF的表達，MTT比色法檢測細胞生長曲線，3H-TdR檢測細胞增殖。結果表明與空白對照組相比，3組序列的mRNA和蛋白質(zhì)表達均有明顯降低，以序列2組下降明顯。細胞增殖能力均顯著下降(P＜0.0

10、5)，IGF-1、SCF表達明顯降低，而對照組無顯著性差異。結果表明TCF4siRNA能顯著下調(diào)DPCTCF4的表達，降低DPC的增殖能力，進一步提示TCF4在DPC生長調(diào)控中可能起到重要作用。 結論: 1.TCF4基因在生長期DPC中高表達。 2.TCF4基因在DPC中過表達使其細胞周期、生長曲線明顯改變，細胞增殖明顯增強，并促進DPC分泌細胞因子。 3.通過RNA干擾降低TCF4基因的表達，可使DPC