KGF-2結構與功能的研究.pdf

1、該實驗利用計算機分子模擬系統對KGF-2與FGFR2IIIb結合的關鍵位點進行了分析,同時綜合同源序列的比較結果,設計并構建了五個KGF-2突變體:AGBH、T114A、T114R、G160H和LY.首先,利用PCR方法克隆了人KGF-2成熟肽的cDNA序列,并以此cDNA為模板,利用重疊延伸PCR方法構建了各突變體的編碼DNA序列.然后,將它們分別插入pET-17b載體中,利用E.coli BL21進行了表達,結果表明重組KGF-2及

2、其各突變體的表達量在13﹪30﹪之間,主要以可溶性形式表達.利用陽離子交換柱對它們進行純化,純度可達90﹪以上.分別利用競爭性ELISA和MTT法進行的受體親合力和對RTE細胞生長作用的檢測結果表明,標準品、重組KGF-2及其突變體均能夠促進RTE細胞的增殖,并且作用效果表現出明顯的劑量依賴特性;重組KGF-2與標準品的受體親合力和促增殖作用基本一致;與重組KGF-2相比,LY的受體親合力和促增殖活性都顯著增加,AGBH的受體親合力稍有

3、增加,但促增殖活性顯著增加,T114A的受體親合力基本不變,但促細胞增殖活性顯著下降,T114R和G160H的受體親合力和促細胞增殖活性都顯著下降.上述結果表明,Thr114、A、B、Gly160和L都是KGF-2重要的FGFR2Ⅲb結合位點及活性位點,它們的改變對KGF-2的受體親合力和活性影響很大.同時,AGBH和T114A在受體親合力沒有很大改變的情況下,促細胞增殖活性卻發(fā)生了極大變化,表明Thr114、A和B對KGF-2激活受體

4、至關重要.利用SGI Origin 300圖形工作站和BIOSYM/MSI分子模擬系統,模建了各突變體的結構.對突變前后各突變位點氨基酸殘基與受體相互作用的分析結果表明,受體親和力的改變是所有發(fā)生變化的作用力相互抵消和均衡的結果,并不取決于某單一作用力的改變.利用酵母雙雜交系統篩選到兩個與KGF-2有相互作用的蛋白質,分別是PR02605和RPL22,但進一步利用哺乳動物雙雜交系統只檢測到RPL22與KGF-2在COS7細胞中的相互作用