PRL-3對(duì)結(jié)直腸癌鈣粘附蛋白相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié).pdf

1、研究背景和目的： 結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，近十年來，結(jié)直腸癌在我國的發(fā)病率有逐年上升的趨勢。轉(zhuǎn)移是影響患者治療效果和導(dǎo)致患者死亡的主要原因。闡明結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機(jī)制及尋找預(yù)防和治療的有效途徑是目前結(jié)直腸癌研究的重要課題。 方法： 1.PRL-3真核綠色熒光蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定設(shè)計(jì)人PRL-3特異性引物，提取人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480細(xì)胞總RNA，應(yīng)用RT-PCR方法獲取人PRL-3全長cDNA，分

2、別克隆至T載體及真核綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-N1，應(yīng)用PCR、酶切及DNA測序進(jìn)行鑒定，確認(rèn)后轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480，應(yīng)用G418進(jìn)行篩選獲取PRL-3穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞克隆，應(yīng)用熒光定量PCR及Westernblot檢測PRL-3基因mRNA和蛋白的表達(dá)。 2.PRL-3基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定設(shè)計(jì)PRL-3基因特異性RNAi靶序列，先與pENTRTTM/U6線性載體定向連接，以構(gòu)建pENTRTM/U6真核入門

3、表達(dá)載體。 3.PRL-3過表達(dá)和表達(dá)敲低對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響利用MTT法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測PRL-3對(duì)細(xì)胞體外增殖的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測PRL-3對(duì)細(xì)胞周期的影響，應(yīng)用運(yùn)動(dòng)小室實(shí)驗(yàn)檢測PRL-3對(duì)結(jié)直腸癌遷移能力的影響；應(yīng)用細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞在I型膠原上的粘附性。 4.PRL-3對(duì)鈣粘附蛋白相關(guān)信號(hào)分子的調(diào)節(jié)作用利用WesternBlot及免疫熒光法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定干擾的細(xì)胞亞克隆鈣粘附蛋白相關(guān)信

4、號(hào)分子如E-cadherin、CDH22、a-catenin、β-catenin、γ-catenin、Snail、β-actin、β-tubulin、GSK-3β、Ezfin、Paxilin的影響。應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測裸鼠皮下成瘤組織中的E-cadherin、CK及vimentin的表達(dá)。應(yīng)用GSK-3β相應(yīng)的磷酸化抗體p-GSK-3β及GSK-3β抑制劑氯化鋰，重點(diǎn)觀察GSK-3β磷酸化與相關(guān)信號(hào)分子調(diào)節(jié)的關(guān)系。 結(jié)果：

5、 1.PRL-3質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及建立穩(wěn)定表達(dá)PRL-3的結(jié)直腸癌細(xì)胞株酶切及DNA測序結(jié)果表明，我們成功獲得522bp的PRL-3基因編碼序列并構(gòu)建了真核綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-N1-PRL-3，該重組載體能夠在SW480細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。將PRL-3質(zhì)粒導(dǎo)入SW480細(xì)胞中，挑取G418抗性單克隆，RT-PCR及Westernblot確定PRL-3在轉(zhuǎn)染克隆2中表達(dá)最強(qiáng)(命名為SW480-EGFP-PRL-3)，PRL-3的空載體

6、對(duì)照為本實(shí)驗(yàn)室所建立的細(xì)胞系SW480/EGFP。 2.通過RNAi技術(shù)沉默結(jié)直腸癌細(xì)胞株P(guān)RL-3表達(dá)，建立PRL-3基因穩(wěn)定敲低的結(jié)直腸癌細(xì)胞株構(gòu)建了三個(gè)PRL-3的慢病毒干擾載體，慢病毒感染SW480/EGFP細(xì)胞，獲得殺稻瘟菌素抗性單克隆，熒光定量PCR和Westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRL-3在干擾克隆1及克隆2中表達(dá)最弱(命名為SW480-PRL-3-KD1和SW480-PRL-3-KD2)，其中SW480-PRL-

7、3-KD1克隆PRL-3的干擾效率達(dá)72.9％。 3.PRL-3基因過表達(dá)及基因敲低后對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響應(yīng)用MTT法，我們檢測了PRL-3對(duì)SW480/EGFP、SW480-EGFP-PRL-3、SW480/EGFP/mock及SW480-PRL-3-KD1細(xì)胞體外增殖能力的影響，經(jīng)析因方差分析，四組差異具有顯著性(F=23.463，P=0.000)；不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞體外增殖的影響差異具有顯著性(F=71.515，P

8、=0.000)；各組細(xì)胞與各時(shí)間組兩因素交互效應(yīng)顯著(F=2.128，P=0.008);除第1天外，其他各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞組間的細(xì)胞增殖差異具有顯著性。經(jīng)LSD法多重比較，結(jié)果表明，與SW480/EGFP/mock和SW480/EGFP細(xì)胞相比，SW480-EGFP-PRL-3細(xì)胞的增殖速度加快，而SW480-PRL-3-KD1細(xì)胞的增殖速度減慢。 4.PRL-3對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞鈣粘附蛋白相關(guān)信號(hào)通路中的調(diào)控作用 1)PRL-3

9、對(duì)相關(guān)鈣粘附蛋白的影響及其與上皮間葉轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)發(fā)生的關(guān)系Westernblot顯示，PRL-3可以誘導(dǎo)鈣粘附蛋白表達(dá)缺失。SW480細(xì)胞自身E-cadherin的表達(dá)缺如或者檢測不到，PRL-3轉(zhuǎn)染對(duì)E-cadherin表達(dá)效應(yīng)的影響無法確定，但當(dāng)我們將PRL-3基因敲低時(shí)，SW480細(xì)胞E-cadherin則恢復(fù)表達(dá)；同時(shí)我們應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù)觀察到E-cadhe

10、fin的表達(dá)定位于細(xì)胞膜，在少量SW480細(xì)胞與細(xì)胞間存在較弱的E-cadherin的表達(dá)，而EGFP-PRL-3轉(zhuǎn)染后其E-cadherin的表達(dá)幾乎不見，而PRL-3敲低后E-cadherin表達(dá)明顯增強(qiáng)，其結(jié)果與westernblot的結(jié)果一致。同時(shí)我們對(duì)前期獲得的PRL-3相互作用蛋白CDH22(PB-cadherin)進(jìn)行了分析，我們發(fā)現(xiàn)PRL-3轉(zhuǎn)染可使得CDH22表達(dá)明顯下降，PRL-3基因敲低CDH22的表達(dá)增加；應(yīng)用間

11、接免疫熒光技術(shù)觀察到CDH22的表達(dá)定位于細(xì)胞膜與細(xì)胞漿，SW480細(xì)胞與PRL-3敲低后的細(xì)胞CDH22的表達(dá)較強(qiáng)，而EGFP-PRL-3轉(zhuǎn)染后其CDH22的表達(dá)相對(duì)較弱。 Snail是參與上皮間葉轉(zhuǎn)化的重要轉(zhuǎn)錄因子。Westernblot結(jié)果顯示，在SW480與SW480-EGFP-PRL-3細(xì)胞中，Snail的表達(dá)較強(qiáng)，而在PRL-3敲低的兩個(gè)克隆中，Snml的表達(dá)受到抑制；Snml與E-cadherin的表達(dá)成負(fù)向關(guān)系，

12、這與PRL-3對(duì)二者的調(diào)節(jié)也是一致的。免疫組織化學(xué)顯示，裸鼠皮下成瘤組織中，上皮性標(biāo)記物E-cadherin、CK在SW480/EGFP和SW480-EGFP-PRL-3瘤細(xì)胞呈較弱的表達(dá)，而在PRL-3基因敲低的SW480-PRL-3-KD1瘤細(xì)胞呈彌漫強(qiáng)表達(dá)；剃葉性標(biāo)記物Vimentin在SW480/EGFP與SW480-PRL-3-KD1瘤細(xì)胞中均未見表達(dá)，而在PRL-3基因過表達(dá)的SW480-EGFP-PRL-3瘤細(xì)胞中Vime

13、ntin在部分區(qū)域呈蔟狀表達(dá)。PRL-3促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。 2)PRL-3對(duì)Catenin家族成員的影響WesternBlot顯示，PRL-3過表達(dá)可引起β-catenin明顯增加，其敲低對(duì)β-catenin的影響不明顯；PRL-3基因敲低抑制了α-catenin的表達(dá)；PRL-3基因敲低可部分增加γ-catenin的表達(dá)。免疫熒光顯示，β-catenin主要呈膜型表達(dá)于SW480細(xì)胞胞膜，轉(zhuǎn)染PRL-3基因后，其膜型

14、表達(dá)特征改變，膜型表達(dá)不連續(xù)，部分細(xì)胞核內(nèi)有明顯β-catenin聚集；γ-catenin在三種細(xì)胞中主要定位于胞膜。 3)GSK-3β磷酸化是PRL-3調(diào)節(jié)鈣粘附蛋白相關(guān)信號(hào)通路的重要方式我們觀察到，PRL-3轉(zhuǎn)染促進(jìn)GSK-3β的表達(dá)，GSK-3β磷酸化較明顯，將PRL-3基因敲低時(shí)，GSK-3β表達(dá)無明顯改變，GSK-3β磷酸化明顯受抑制；氯化鋰可以促進(jìn)GSK-3β的磷酸化而抑制GSK-3β，我們?cè)赟W480、SW480-

15、EGFP-PRL-3、SW480-PRL-3-KD1及SW480-PRL-3-KD2等不同的細(xì)胞中，均觀察到氯化鋰可以促進(jìn)GSK-3β的磷酸化，并且這種影響在轉(zhuǎn)染EGFP-PRL-3的SW480細(xì)胞尤為明顯；PRL-3轉(zhuǎn)染促進(jìn)snail表達(dá)增加，snail在調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞間葉轉(zhuǎn)化(EMT)中起重要作用，PRL-3敲低可抑制snail的表達(dá)，應(yīng)用氯化鋰處理PRL-3敲低的SW480細(xì)胞，其snail表達(dá)明顯恢復(fù)；有意義的是，我們發(fā)現(xiàn)氯化鋰處

16、理可以恢復(fù)PRL-3敲低SW480細(xì)胞PRL-3的表達(dá)。 4)PRL-3對(duì)細(xì)胞骨架相關(guān)信號(hào)分子的影響我們觀察到PRL-3轉(zhuǎn)染使得Ezrin表達(dá)減少，將PRL-3基因敲低時(shí)，Ezrin的表達(dá)略增加；PRL-3轉(zhuǎn)染或敲低對(duì)于β-Tubulin的表達(dá)無明顯影響；PRL-3轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)Paxillin表達(dá)減少，但在SW480-PRL-3-KD1和SW480-PRL-3-KD2兩個(gè)PRL-3基因敲低的細(xì)胞中Paxillin的表達(dá)不一致。

17、 結(jié)論： 1.PRL-3基因是結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、粘附、遷移的促進(jìn)基因； 2.PRL-3是結(jié)直腸癌細(xì)胞粘附和上皮間葉轉(zhuǎn)化重要的調(diào)節(jié)因子，PRL-3通過誘導(dǎo)E-cadherin及CDH22表達(dá)下調(diào)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮間葉轉(zhuǎn)化； 3.PRL-3通過促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的聚集和GSK-3β磷酸化參與鈣粘附蛋白相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。 本研究的創(chuàng)新之處： 1、構(gòu)建了PRL-3過表達(dá)和敲低的相關(guān)載