活細(xì)胞可視化研究NMDA受體在神經(jīng)元的表面表達(dá)、分布及其與突觸形成和功能的關(guān)系.pdf

1、在該研究中,我們分別構(gòu)建了GFP標(biāo)記NMDA受體NR1、NR2和NR28亞單位的真核表達(dá)載體,經(jīng)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞證實這些GFP標(biāo)記的受體亞單位具有良好的熒光信號,同時具有與相應(yīng)野生型亞單位相同的通道功能特征.以這些載體為工具,結(jié)合活細(xì)胞表面受體免疫染色技術(shù),我們作了如下研究:(1)為研究NMDA受體在HEK細(xì)胞表面表達(dá)及其可能相關(guān)的調(diào)節(jié)機(jī)制,先用不同的GFP標(biāo)記NMDA受體亞單位轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,然后采用抗GFP抗體和C

2、y3交聯(lián)的二抗對轉(zhuǎn)染細(xì)胞作活細(xì)胞表面染色,分析了NR1亞單位不同的剪接變體、NR1和RN2的裝配、以及PKC激活對NMDA受體在HEK293細(xì)胞表面表達(dá)的影響.(2)觀察GFP標(biāo)記NMDA受體亞單位在培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的表達(dá)和表面受體的免疫熒光染色.(3)采用NMDA受體亞單位特異性抗體對GFP標(biāo)記亞單位轉(zhuǎn)染神經(jīng)元作免疫組化分析,觀察外源表達(dá)亞單位的GFP熒光受體簇與內(nèi)源性NMDA受體亞單位熒光染色受體簇之間的共定位.(4)通過共轉(zhuǎn)染CFP