肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A、分泌性磷脂酶A-,2--Ⅱ在急性胰腺炎肺損傷中的作用及清胰湯干預(yù)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 探討重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)肺損傷(acutelung iniury，ALI)時(shí)肺表面活性蛋白A(surfactant protein A，SP-A)、分泌型磷脂酶A2-Ⅱ(secreted phospholipase A2，sPLA2-Ⅱ)的表達(dá)，及其在ALI發(fā)病中的作用，同時(shí)觀察肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar type Ⅱ cells，AT Ⅱ)在急性胰腺炎肺損

2、傷時(shí)的形態(tài)及功能改變，并觀察清胰湯對(duì)SP-A、sPLA2-Ⅱ表達(dá)及病情轉(zhuǎn)歸的影響。急性重癥胰腺炎時(shí)增高的sPLA2-Ⅱ?qū)T Ⅱ細(xì)胞損傷作用是引起急性胰腺炎肺損傷的重要因素，急性胰腺炎相關(guān)性腹水中sPLA2含量明顯增高。本研究進(jìn)一步行ATⅡ細(xì)胞原代培養(yǎng)，用大鼠SAP模型腹水干預(yù)細(xì)胞，觀察細(xì)胞增殖狀況和生存率改變；并分別應(yīng)用sPLA2-Ⅱ抑制劑(KH064)、Emodin干預(yù)，觀察其對(duì)腹水預(yù)處理AT Ⅱ細(xì)胞增殖、SP-A表達(dá)的影響，及對(duì)細(xì)

3、胞形態(tài)功能的影響。進(jìn)一步揭示SP-A、sPLA2 Ⅱ及AT Ⅱ細(xì)胞在急性胰腺炎肺損傷發(fā)病中的作用，為臨床治療急性肺損傷尋求更為合適的藥物作用靶點(diǎn)。 方法： 實(shí)驗(yàn)一：采用膽胰管內(nèi)逆行注入1.5％去氧膽酸鈉建立大鼠SAP時(shí)ALI模型。將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO組，n=10)、模型組(SAP組，n=10)、清胰湯組(QYT組，n=10)、地塞米松組(DEX組，n=10)、善寧組(SS組，n=101和分泌型磷脂酶A2-Ⅱ抑

4、制劑組(KH064，n=10)。SO組僅行剖腹術(shù)，翻動(dòng)胰腺。QYT組在建立SAP模型后30 min、12h清胰湯灌胃(10 mL/kg)。DEX組于造模后30min、12h靜脈注射地塞米松(10mg/kg)。SS組在造模后30min、12h皮下注射善寧(50 μg/kg)。KH064組于造模后30min、12h給予KH064灌胃(5mg/kg)。各組動(dòng)物在術(shù)后24 h測(cè)PaO2、PaCO2、pH和血淀粉酶、sPLA2、肺濕/干比。應(yīng)用逆

5、轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)肺組織SP-A、sPLA2-Ⅱ mRNA的表達(dá)強(qiáng)度，采用Western-bolt檢測(cè)肺組織SP-A、sPLA2-Ⅱ表達(dá)，免疫組化觀察肺組織SP-A表達(dá)，并觀察胰、肺病理變化及ATⅡ細(xì)胞的電鏡下變化。 實(shí)驗(yàn)二：采用Dobbs方法提取AT Ⅱ細(xì)胞，首先肺動(dòng)脈灌洗減少肺內(nèi)紅細(xì)胞，肺離體后經(jīng)氣管灌洗除去肺泡腔內(nèi)的白細(xì)胞，將胰蛋白酶、膠原酶灌入肺內(nèi)消化分離細(xì)胞；采用免疫貼附法純化細(xì)胞，巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)

6、胞和中性粒細(xì)胞等細(xì)胞表面有IgG的Fc段受體，將細(xì)胞懸液培養(yǎng)子覆被IgG的平皿中，有Fc段受體的細(xì)胞被粘附，而無(wú)Fc段受體的ATⅡ細(xì)胞得以純化。AT Ⅱ細(xì)胞的鑒定采用電子顯微鏡和SP-A免疫組化染色，其在電子顯微鏡下有特征性板層小體，免疫組化染色見(jiàn)細(xì)胞漿有SP-A表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)三：10只雄性SPF SD大鼠，采用膽胰管內(nèi)逆行注入1.5％去氧膽酸鈉建立大鼠SAP時(shí)ALI模型，留取腹水，檢測(cè)腹水sPLA2活性后分裝，-80℃保存。按前

7、述方法分離、提取、培養(yǎng)ATⅡ細(xì)胞，腹水預(yù)處理按腹水終濃度為12.5 μl/ml、25μl/ml、50μl/ml和100μl/ml加入培養(yǎng)液，分6、12、24h三個(gè)時(shí)點(diǎn)，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況和細(xì)胞生存率。根據(jù)細(xì)胞增殖情況，選用腹水預(yù)處理濃度為25 μ l/ml，預(yù)處理時(shí)間24h，培養(yǎng)孔KH064干預(yù)終濃度為：0 μ g/ml、0.5 μ g/ml、1 μ g/ml、2 μ g/ml、4 μ g/ml，培養(yǎng)孔Emodin干預(yù)終濃度為

8、：0μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇藥物干預(yù)劑量為：KH0641μg/ml、2μg/ml，Emodin 10μg/ml，20μg/ml。腹水預(yù)處理組腹水劑量分別為：12.5、25、50、100μl/ml培養(yǎng)液，預(yù)處理時(shí)間為24h。腹水預(yù)處理組和藥物干預(yù)組分別提取RNA和蛋白，檢測(cè)SP-AmRNA和蛋白的表達(dá)。電子顯微鏡觀察ATⅡ細(xì)胞。 結(jié)果：

9、 SAP組血淀粉酶顯著高于SO組和各治療組(P<0.05)。SAP組PaO2、pH顯著低于SO組和治療組(P<0.05)，SAP組PaCO2、肺W/T顯著高于SO組和治療組(P<0.05)。SAP組血清sPLA2顯著高于SO組(P<0.05)，QYT、DEX、KH064組血sPLA2與SAP組比較有顯著降低(P<0.05)，SS組血sPLA2與SAP組比較差別無(wú)顯著性。SAP組SP-A mRNA表達(dá)較SO組顯著降低(P<0.05

10、)，QYT、DEX、KH064組SP-A mRNA表達(dá)較SAP組顯著增高(P<0.05)，SS組SP-A mRNA表達(dá)與SAP組比較無(wú)顯著變化。各組SP-AmRNA表達(dá)與肺損傷評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。SO組SP-A蛋白有明顯表達(dá)，與SO組比較，SAP組SP-A表達(dá)顯著降低，治療組與SAP組比較SP-A表達(dá)增高，其中QYT、DEX、KH064組增高明顯。肺組織免疫組化SAP組SP-A表達(dá)較SO組顯著降低(P<0.05)，各治療組SP

11、-A表達(dá)較SAP組有顯著增高(P<0.05)。與SO組比較SAP組sPLA2-Ⅱ mRNA、蛋白表達(dá)顯著增高，除SS組外其他各治療組sPLA2-Ⅱ mRNA、蛋白表達(dá)較SAP組顯著降低。治療組肺組織病理及電鏡改變較SAP組明顯好轉(zhuǎn)，以QYT、KH064組好轉(zhuǎn)明顯。 純化前可得約5×108個(gè) ATⅡ細(xì)胞/只鼠，IgG免疫粘附純化后細(xì)胞數(shù)約為1.6×107個(gè)／只。臺(tái)盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞活力為95％以上。通過(guò)SP-A免疫組化染色判定，純化

12、后ATⅡ細(xì)胞純度可達(dá)92％。 光學(xué)顯微鏡檢查見(jiàn)隨預(yù)處理腹水劑量增加，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)變差，并出現(xiàn)細(xì)胞死亡。KH064、Emodin干預(yù)組細(xì)胞生長(zhǎng)良好。MTT結(jié)果顯示，腹水呈劑量依賴方式抑制大鼠ATⅡ細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞生存率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)降低。KH064濃度為0.5-2μl/ml時(shí)，細(xì)胞增殖較對(duì)照組明顯增高，并呈劑量依賴性；Emodin濃度為10-40 μl/ml時(shí)，細(xì)胞增殖較對(duì)照組有顯著增高，并呈劑量依賴性。隨著干預(yù)腹水濃度的增高，A

13、TⅡ細(xì)胞SP-AmRNA的表達(dá)降低，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。KH064和Emodin干預(yù)組SP-AmRNA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，各干預(yù)組不同劑量之間SP-AmRNA的表達(dá)水平無(wú)顯著差別(P>0.05)。腹水預(yù)處理組AT Ⅱ細(xì)胞SP-A蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組，并隨腹水預(yù)處理劑量的增高SP-A的表達(dá)降低，呈現(xiàn)劑量依賴性。KH064和Emodin干預(yù)組AT Ⅱ細(xì)胞SP-A蛋白的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。KH064和Emodi

14、n干預(yù)組AT Ⅱ細(xì)胞電子顯微鏡下改變較腹水預(yù)處理組明顯減輕。 結(jié)論： 急性胰腺炎肺損傷時(shí)，AT Ⅱ細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致SP-AmRNA表達(dá)減少，進(jìn)而使肺表面活性物質(zhì)中SP-A表達(dá)降低，其對(duì)sPLA2-Ⅱ抑制作用降低，使后者表達(dá)增高，從而加速肺泡表面活性物質(zhì)磷脂水解，導(dǎo)致肺泡表面張力增加，肺泡萎陷，最終導(dǎo)致ARDS。SP-A和sPLA2-Ⅱ的平衡在急性胰腺炎肺損傷發(fā)生中起關(guān)鍵作用。中藥清胰湯在急性胰腺炎肺損傷時(shí)起保護(hù)AT Ⅱ

15、細(xì)胞的作用，增加肺組織SP-A表達(dá)，同時(shí)降低肺組織sPLA2-Ⅱ表達(dá)，具有維持肺泡表面活性物質(zhì)的功能，從而保持良好肺泡表面張力，防止ALI。地塞米松可能通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)，間接增加肺組織SP-A的表達(dá)，降低肺組織sPLA2-Ⅱ的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)保護(hù)肺功能的作用。善寧明顯降低急性胰腺炎血淀粉酶水平，對(duì)SP-A、sPLA2-Ⅱ表達(dá)無(wú)顯著影響。 分離、純化大鼠AT Ⅱ細(xì)胞時(shí)，合適的胰蛋白酶濃度及作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞活性有重要作用，大鼠IgG粘附純化

16、可以得到高純度的AT Ⅱ細(xì)胞，可以通過(guò)電子顯微鏡觀察板層小體和免疫組化染色檢測(cè)細(xì)胞SP-A表達(dá)鑒定ATⅡ細(xì)胞。 胰腺炎腹水抑制ATⅡ細(xì)胞增殖，隨著腹水濃度增高、作用時(shí)間延長(zhǎng)其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯劑量、時(shí)間依賴性。sPLA2-Ⅱ抑制劑可以減輕腹水對(duì)AT Ⅱ細(xì)胞的損傷，表明腹水中對(duì)細(xì)胞損傷起主要作用的物質(zhì)可能是sPLA2-Ⅱ。Emodin也有減輕腹水對(duì)AT Ⅱ細(xì)胞的損傷作用，其可能主要通過(guò)抑制sPLA2-Ⅱ活性，減輕