鈦微粒對成骨細(xì)胞護(hù)骨素-護(hù)骨素配體表達(dá)的調(diào)控及TGF-β-,1-的干預(yù)研究.pdf

1、第一部分:實驗用細(xì)胞可吞噬鈦微粒的制備與表征分析目的：通過無水乙醇液力分級法分離Ti微粒，探討從產(chǎn)工業(yè)純Ti粉中分離細(xì)胞可吞噬Ti微粒的方法，為人工關(guān)節(jié)假體松動相關(guān)研究提供實驗用材料。方法：將100g國產(chǎn)工業(yè)純Ti粉置入玻璃燒杯中，加入無水乙醇1500ml，充分?jǐn)嚢杌旌?，室溫下靜置后，從上層混懸液中收集Ti微粒，采用粒度分析儀及掃描電鏡觀察Ti微粒表征。 結(jié)果：獲得的Ti微粒肉眼觀與Ti粉相似，但體積較其明顯細(xì)小，平均粒徑約為(

2、1.169±0.484)μm，99.7％＜3μm，粒徑分布曲線呈正態(tài)分布；掃描電鏡觀察見Ti微粒呈類球形，均勻，分散性好。 結(jié)論：本方法分離的Ti微粒表面特征與國外文獻(xiàn)報道中所用微粒相似，無水乙醇重力液力分級法能有效地分離Ti微粒，可用于實驗用Ti微粒的分離制備。 第二部分:實驗用鈦微粒細(xì)菌內(nèi)毒素的去除與檢測 目的：細(xì)菌內(nèi)毒素易附著于磨損微粒表面，可導(dǎo)致骨溶解，探討酸處理法去除實驗用Ti微粒內(nèi)毒素的有效性及其檢測

3、方法，有助于進(jìn)行人工關(guān)節(jié)假體松動的相關(guān)研究。 方法：用25％硝酸浸泡Ti微粒，70℃，1h，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水制成0.03％(w/v)Ti微粒混懸液，取其浸提液，然后采用凝膠法鱟試驗檢測其表面內(nèi)毒素含量是否超標(biāo)。 結(jié)果：樣品對高靈敏度鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)不產(chǎn)生干擾作用，Ti微粒表面內(nèi)毒素含量小于0.06EU/mL。 結(jié)論：高溫酸處理法能有效地將Ti微粒表面細(xì)菌內(nèi)毒素控制在0.06EU/mL以內(nèi)，而采用高靈敏度鱟

4、試劑進(jìn)行實驗用Ti微粒細(xì)菌內(nèi)毒素檢測是可行的。 第三部分:成骨細(xì)胞護(hù)骨素/護(hù)骨素配體基因表達(dá)的體外研究 目的：成骨細(xì)胞既是骨形成的重要細(xì)胞，也是破骨細(xì)胞激活與成熟的必要條件，觀察體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞在無干預(yù)因素存在時，OPG與OPG-L基因的表達(dá)水平，為進(jìn)一步研究作準(zhǔn)備。 方法：常規(guī)培養(yǎng)的MG-63細(xì)胞，當(dāng)血清饑餓24h后，繼續(xù)培養(yǎng)0h、12h、24h、36h及48h，半定量RT-PCR觀察該細(xì)胞OPG及OPG-L

5、mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果:MG-63細(xì)胞對OPG及OPG-LmRNA均有表達(dá)，OPG基因的豐度較OPG-LmRNA高，當(dāng)培養(yǎng)時間大于12h時，MG-63細(xì)胞的OPG基因表達(dá)增加及OPG-LmRNA表達(dá)下降均呈時間依賴性。 結(jié)論:人成骨樣MG-63細(xì)胞為具有人成骨細(xì)胞表型的成骨細(xì)胞模型，成骨細(xì)胞OPG的高表達(dá)與OPG-L的低表達(dá)水平代表著成骨細(xì)胞抑制骨溶解吸收、有效偶聯(lián)骨形成與骨吸收的功能狀態(tài)。 第四部分:鈦微粒

6、對成骨細(xì)胞護(hù)骨素/護(hù)骨素配體表達(dá)的體外調(diào)控 目的：繼發(fā)于假體周圍骨溶解的無菌性松動是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后中期和晚期失敗的最重要原因，通過可吞噬Ti微粒干預(yù)成骨細(xì)胞，探討磨損微粒對OPG、OPG-L表達(dá)的影響及其引起假體周圍骨溶解的機(jī)制，為人工關(guān)節(jié)假體松動的預(yù)防研究打下基礎(chǔ)。 方法：MG-63細(xì)胞在無酚紅的MEM培養(yǎng)基中單層培養(yǎng)，采用不同濃度細(xì)胞可吞噬鈦微粒(粒徑小于3μm)對其進(jìn)行24h干預(yù)或采用0.05％(w/v)鈦微粒干

7、預(yù)0h、12h、24h、36h及48h，用MTT法觀察不同濃度和不同作用時間對細(xì)胞增殖的影響，用半定量RT-PCR技術(shù)和Westernblot雜交檢測其對OPG、OPG-L表達(dá)的調(diào)控與微粒濃度、干預(yù)時間及微粒成分的關(guān)系，用放線菌酮(CHX)干預(yù)Ti微粒刺激成骨細(xì)胞OPG及OPG-LmRNA的表達(dá)。 結(jié)果：(1)隨著濃度的增高，Ti微粒抑制MG-63細(xì)胞增殖作用逐漸增大，從0(即空白對照組)到0.005％之間，細(xì)胞增殖降低呈劑量依

8、賴性；而當(dāng)干預(yù)時間從0h延長至48h時，Ti微粒促進(jìn)細(xì)胞增殖，且當(dāng)時間大于12h時，這種增殖效應(yīng)呈時間依賴性。(2)Ti微粒能不同程度地上調(diào)成骨細(xì)胞OPG及OPG-L基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)，且對OPG-L的上調(diào)程度大于OPG；其作用呈微粒濃度(OPG：不大于0.005％，OPG-L：大于0.0025％)、干預(yù)時間(大于12h)及微粒成分依賴性。(3)CHX并不影響Ti微粒上調(diào)成骨細(xì)胞OPG及OPG-L基因的表達(dá)。 結(jié)論：在假體周圍骨

9、溶解過程中，磨損微粒能直接上調(diào)成骨細(xì)胞OPG和OPG-L的表達(dá)水平，即抑制和促進(jìn)骨溶解吸收能力均增加，但前者增加程度小于后者，使OPG-L/OPG比值呈有利于骨溶解的方向變化，這可能是磨損微粒引起人工關(guān)節(jié)假體松動的重要發(fā)病機(jī)制之一。早期干預(yù)，降低OPG-L/OPG的比值有可能預(yù)防或逆轉(zhuǎn)此病理過程。 第五部分:TGF-β1對鈦微粒刺激成骨細(xì)胞OPG及OPG-L表達(dá)的干預(yù)研究 目的：TGF-β1為重要骨生長因子，通過觀察其對

10、Ti微粒(粒徑小于3μm)刺激成骨細(xì)胞表達(dá)OPG及OPG-L的影響，探討預(yù)防人工關(guān)節(jié)假體松動的可能性。方法：常規(guī)培養(yǎng)MG-63細(xì)胞，分四組進(jìn)行干預(yù)：①空白對照組；②0.005％Ti微粒；③TGF-β1(2ng/ml)加0.005％Ti微粒；④TGF-β1(2ng/ml)。用MTT法觀察其對細(xì)胞增殖的影響，用半定量RT-PCR技術(shù)和Westernblot雜交檢測其對OPG、OPG-L表達(dá)的調(diào)控。 結(jié)果：與對照組比較，Ti微粒顯著抑

11、制成骨細(xì)胞增殖，而TGF-β1組則起促進(jìn)作用，且能有效地拮抗并逆轉(zhuǎn)Ti微粒對細(xì)胞增殖的抑制。在OPG表達(dá)方面，TGF-β1上調(diào)作用強(qiáng)于Ti微粒，且對Ti微粒OPG表達(dá)的上調(diào)具顯著促進(jìn)作用。在OPG-L的表達(dá)方面，Ti微粒具上調(diào)作用，而TGF-β1與之相反，且能有效地逆轉(zhuǎn)Ti微粒對OPG-L表達(dá)的上調(diào)。 結(jié)論：TGF-β1可有效地干預(yù)磨損微粒引起的假體周圍骨溶解，改善微粒引起的成骨細(xì)胞功能變化，有望成為防治骨溶解、預(yù)防人工關(guān)節(jié)假體