人HSP22基因在造血系統(tǒng)惡性腫瘤中的表達(dá)及作用研究.pdf

1、1980年Craig和McCarthy首次在黑腹果蠅基因組中分離了HSP22基因，2000年Smith等人從HELA細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞基因文庫中發(fā)現(xiàn)了人HSP22基因。它由196個(gè)氨基酸組成，分子量為22kD，具有小分子熱休克蛋白(sHSP)家族保守的中央“晶體蛋白結(jié)構(gòu)域(α-crystallin)”。HSP22的mRNA在肌肉、胎盤、心臟和腦組織中高度表達(dá)，目前研究顯示HSP22具有分子伴侶，自身激酶等生物活性，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋

2、亡，其異常表達(dá)或突變與心肌肥大、阿爾茨海默癥及遠(yuǎn)側(cè)遺傳性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病等疾病密切相關(guān)。隨著研究的不斷深入，HSP22與腫瘤的關(guān)系越來越受到人們的關(guān)注，近幾年來發(fā)現(xiàn)HSP22高表達(dá)于雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞并能被17β-雌二醇(17β-Estradiol，E2)誘導(dǎo)上調(diào)進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展；然而HSP22在有些腫瘤組織或細(xì)胞系中低表達(dá)，例如黑色素瘤、前列腺癌及肉瘤，而且通過去甲基化試劑5-aza-2′-deoxycytidine(地西他濱，

3、Aza-C，達(dá)珂TM)處理，或轉(zhuǎn)導(dǎo)HSP22能誘導(dǎo)人黑色素瘤細(xì)胞系SK-MEL-2和人前列腺癌細(xì)胞系PC-3凋亡。可見HSP22在腫瘤中的作用是多樣的。
　　 為了研究HSP22在血液系統(tǒng)腫瘤中的表達(dá)和功能，我們首先采用RT-PCR方法檢測(cè)HSP22在造血系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況。在被檢測(cè)的代表不同來源的13個(gè)造血系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞系、20例不同類型的白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞及10例健康志愿者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中均未發(fā)現(xiàn)HSP2

4、2的表達(dá)。由于熱休克蛋白家族是應(yīng)激蛋白，當(dāng)細(xì)胞受到高溫、物理或化學(xué)刺激的時(shí)候其表達(dá)會(huì)顯著上升。于是我們進(jìn)一步用熱休克、E2、阿糖胞苷（cytarabine，Ara-c）、柔紅霉素(Daunorubicin，DRN)及Aza-C等處理白血病細(xì)胞系及白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)只有地西他濱能誘導(dǎo)HSP22表達(dá)，且呈劑量依賴。于是我們推測(cè)在HSP22基因的啟動(dòng)子區(qū)存在甲基化。為了證實(shí)此推測(cè)，我們用甲基化特異的PCR方法檢測(cè)了5個(gè)白血病細(xì)胞系

5、及5例健康供者和15例不同類型的白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中HSP22基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)的所有樣本呈現(xiàn)完全甲基化狀態(tài)，而且，地西他濱處理過的白血病細(xì)胞系甲基化狀態(tài)被部分逆轉(zhuǎn)，呈現(xiàn)部分去甲基化狀態(tài)。
　　 地西他濱是一種去甲基化藥物，具有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)細(xì)胞分化能力，目前臨床用于治療骨髓增生異常綜合征(MDS)、慢性粒細(xì)胞白血病(CML)和急性髓細(xì)胞白血病(AML)，并且旨在將其應(yīng)用于更多腫瘤治療中的臨床實(shí)驗(yàn)正在不斷開展。

6、甲磺酸伊馬替尼(伊馬替尼，imatinibmesylate，gleevec)是BCR/ABL+白血病最有效的治療藥物，近年來有文獻(xiàn)證明地西他濱與伊馬替尼對(duì)BCR/ABL+的細(xì)胞具有協(xié)同的抗白血病功能，增強(qiáng)白血病細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的敏感性。我們的研究結(jié)果提示，接受地西他濱治療會(huì)使患者白血病細(xì)胞表達(dá)HSP22，而且多數(shù)熱休克蛋白家族成員都與藥物的敏感性相關(guān)，那么HSP22的表達(dá)會(huì)對(duì)白血病細(xì)胞產(chǎn)生什么作用，是否參與介導(dǎo)了地西他濱增強(qiáng)白血病細(xì)胞對(duì)伊

7、馬替尼的敏感性呢？為了進(jìn)一步探究HSP22對(duì)白血病細(xì)胞的影響，我們構(gòu)建了HSP22慢病毒表達(dá)載體，感染K562和Namalwa細(xì)胞，熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀觀察并測(cè)試瞬時(shí)感染效率，RT-PCR和WestemBlot方法鑒定HSP22的表達(dá)。并通過生長曲線、細(xì)胞周期、集落形成實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞增殖、生長特性、集落形成能力，AnnexinV/7-AAD方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)導(dǎo)空載體的對(duì)照細(xì)胞相比，HSP22能抑制K562細(xì)胞

8、體內(nèi)增殖和Namalwa細(xì)胞體外增殖，并抑制二者集落形成，但對(duì)于二者的細(xì)胞周期和凋亡沒有明顯影響。為了進(jìn)一步探究HSP22是否可使白血病細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的的敏感性增強(qiáng)，是否參與介導(dǎo)了地西他濱與伊馬替尼的協(xié)同作用，我們用伊馬替尼處理轉(zhuǎn)導(dǎo)HSP22和空載體的K562(BCR/ABL+)細(xì)胞，并用AnnexinV/7-AAD方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)HSP22能增強(qiáng)伊馬替尼誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡，此現(xiàn)象具有劑量和時(shí)間依賴性。為了進(jìn)一步明確HSP

9、22增加腫瘤細(xì)胞對(duì)伊馬替尼敏感性的機(jī)制，我們采用real-timePCR方法檢測(cè)了轉(zhuǎn)導(dǎo)HSP22和空載體的K562細(xì)胞mdrl和BCR/ABL基因的表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)導(dǎo)HSP22使K562細(xì)胞中這兩種基因的表達(dá)水平顯著降低，提示HSP22增加腫瘤細(xì)胞對(duì)伊馬替尼敏感性的作用可能是通過降低P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能從而減少伊馬替尼的泵出以及減少BCR/ABL融合蛋白的表達(dá)從而降低其酪氨酸激酶的活性來實(shí)現(xiàn)的

10、。由于地西他濱能夠誘導(dǎo)多種基因表達(dá)，為了進(jìn)一步確定HSP22是否在介導(dǎo)地西他濱與伊馬替尼的協(xié)同抗白血病功能中起到特異的作用，我們?cè)诘匚魉麨I誘導(dǎo)野生型K562細(xì)胞表達(dá)HSP22的基礎(chǔ)上使用HSP22基因特異的siRNA干擾其表達(dá)，再使用伊馬替尼處理，發(fā)現(xiàn)干擾HSP22的表達(dá)能降低伊馬替尼誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡。提示HSP22可能在介導(dǎo)地西他濱與伊馬替尼的協(xié)同作用中發(fā)揮特異的作用。
　　 綜上所述，我們的工作首次證明，在血液系統(tǒng)中，

11、啟動(dòng)子區(qū)甲基化是HSP22不表達(dá)的原因，去甲基化試劑地西他濱能夠誘導(dǎo)HSP22的表達(dá)。異位表達(dá)HSP22能抑制白血病細(xì)胞的增殖和集落形成，并能增強(qiáng)BCR/ABL+的K562細(xì)胞系對(duì)伊馬替尼的敏感性。而且此功能可能是通過降低P-糖蛋白(P-glycoprotein)轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能和減少BCR/ABL融合蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。RNA干擾實(shí)驗(yàn)顯示降低HSP22的表達(dá)能減少伊馬替尼誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡，提示HSP22可能在介導(dǎo)地西他濱與伊馬替尼的