磁共振功能成像用于超聲微泡—納米脂質(zhì)體復(fù)合體介導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因治療肝纖維化的研究.pdf

1、肝纖維化是肝臟各種慢性損傷導(dǎo)致纖維素沉積形成，進(jìn)而改變肝臟組織結(jié)構(gòu)和功能，甚至引起肝硬化和肝衰竭。基因治療肝纖維化是一種新的有效治療手段。目前許多生長(zhǎng)因子已成功用于肝纖維化基因治療。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)能促進(jìn)成熟細(xì)胞有絲分裂，是有潛力的抗纖維化因子，能夠防止許多器官纖維化，包括肝臟。可是缺乏一種安全有效的基因傳遞載體一直是臨床應(yīng)用的障礙。微泡是臨床醫(yī)學(xué)影像超聲的顯像劑，能在超聲波引導(dǎo)下產(chǎn)生空化效應(yīng)，利用這種特征傳遞基因可提高轉(zhuǎn)染效率

2、。但微泡在體內(nèi)通常不穩(wěn)定，并且直徑大約1-6um，無法滲透出靜脈，而且靶向分子很難在微泡表面修飾。脂質(zhì)體作為藥物和基因傳遞載體都很有優(yōu)勢(shì)，但轉(zhuǎn)染效率低，并且沒有靶向性。因此，我們應(yīng)用生物素-親和素系統(tǒng)結(jié)合超聲微泡和陽離子納米脂質(zhì)體形成生物素化超聲微泡和生物素化陽離子納米脂質(zhì)體復(fù)合體(Bio-MB+Bio-CNLP)載體。有效克服兩者的不足，明顯提高轉(zhuǎn)染效率，經(jīng)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Bio-MB+Bio-CNLP能攜帶HGF基因靶向治療肝纖維

3、化，是一種新型有效的基因載體。
　　 肝活組織檢查一直是肝纖維化診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但具有有創(chuàng)性、少數(shù)可見并發(fā)癥及樣本誤差等缺點(diǎn)限制了臨床使用。急需研究一種無創(chuàng)、有效評(píng)估肝纖維化程度的診斷技術(shù)。這種技術(shù)必須沒有活組織檢查的風(fēng)險(xiǎn)，能簡(jiǎn)單、方便有效評(píng)估抗纖維化程度及治療效果。本實(shí)驗(yàn)我們通過膽總管結(jié)扎術(shù)建立大鼠肝纖維化模型，尾靜脈注射Bio-MB+Bio-CNLP-pCDH-HGF載體，治療后分別用磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像(diffusion-w

4、eighted imaging，DWI)、磁共振灌注成像（Perfusionimaging，PWI）和磁共振波普分析(magnetic aesonance spectroscopy，MRS)三種MRI功能成像評(píng)估治療效果。結(jié)果表明磁共振功能成像能準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)肝纖維化發(fā)展過程，評(píng)估肝纖維化治療效果。本研究顯示三種MRI功能成像參數(shù)能定量分析肝纖維化，與肝纖維化分期具有顯著相關(guān)性，可以為臨床診斷和評(píng)估肝纖維化治療提供依據(jù)。
　　 第一部

5、分 Bio-MB+Bio-CNLP介導(dǎo)HGF基因治療肝纖維化生物學(xué)效應(yīng)的體外初步研究
　　 目的:構(gòu)建一個(gè)新型的生物素化超聲微泡基因載體，評(píng)估載體介導(dǎo)HGF基因的靶向性和安全性以及對(duì)肝臟細(xì)胞的作用
　　 方法:運(yùn)用生物素-親和素系統(tǒng)構(gòu)建Bio-MB+Bio-CNLP載體并且和HGF基因重組;分別轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)和肝細(xì)胞(L02)，分為4組:(1)Bio-MB+Bio-CNLP+HGF無超聲輻照;(2)Bio

6、-MB+Bio-CNLP+HGF超聲輻照;(3)脂質(zhì)體+HGF;(4)Bio-MB+Bio-CNLP超聲輻照。轉(zhuǎn)染成功后分別用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染率和凋亡率;細(xì)胞免疫熒光染色、ELISA和Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá);MTT檢測(cè)細(xì)胞活性。
　　 結(jié)果:超聲輻照組轉(zhuǎn)染成功，而無超聲輻照組則無轉(zhuǎn)染;與單獨(dú)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染比較，Bio-MB+Bio-CNLP介導(dǎo)HGF明顯提高轉(zhuǎn)染率;HGF基因轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞后72小時(shí)蛋白表達(dá)量最

7、高，細(xì)胞凋亡率明顯增加;而轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞活性明顯增加。
　　 結(jié)論:Bio-MB+Bio-CNLP能靶向傳遞HGF基因并明顯提高轉(zhuǎn)染率，促進(jìn)HSC細(xì)胞凋亡，增加正常干細(xì)胞活性，表明我們成功制備了一種新型的具有靶向性、安全性和有效性Bio-MB+Bio-CNLP載體。
　　 第二部分磁共振功能成像對(duì)大鼠肝纖維化診斷、定量分析研究
　　 目的:探索一種新型靶向超聲微泡載體介導(dǎo)HGF基因體內(nèi)表達(dá)治療肝纖維化，并且通過M

8、RI功能成像檢測(cè)療效。
　　 方法:通過膽總管結(jié)扎構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，尾靜脈注射Bio-MB+Bio-CNLP+HGF懸液，肝臟超聲輻照定位轉(zhuǎn)遞HGF基因治療。分別運(yùn)用DWI、PWI和MRS三種功能成像檢測(cè)治療效果，并與病理檢查結(jié)果對(duì)照。
　　 結(jié)果:我們靶向傳遞HGF基因并且產(chǎn)生抗纖維化效果;MRI功能成像各參數(shù)能準(zhǔn)確區(qū)分肝纖維化分期。
　　 結(jié)論:Bio-MB+Bio-CNLP在體內(nèi)能靶向傳遞HGF基因，有