自體轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療下肢缺血的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 1.探討脂質(zhì)體介導(dǎo)的人Angl、VEGF165基因轉(zhuǎn)染自體骨髓EPCs移植治療缺血下肢的效果。 2.探討CTA、DSA及超聲多普勒檢查對(duì)缺血下肢側(cè)支循環(huán)形成評(píng)價(jià)的敏感性，并比較各檢查的差異性。 方法： 1.高血膽固醇兔模型的制作 健康3-4月齡日本大耳兔24只，平均體重2.0-2.5kg，適應(yīng)環(huán)境一周后給予高膽固醇飼料100g/d，喂養(yǎng)至細(xì)胞移植術(shù)后(喂養(yǎng)時(shí)間至少1個(gè)月)，于喂養(yǎng)的第7天及

2、第15天分別行靜脈注射白蛋白250mg/kg。 2.日本大耳兔脛骨近端穿刺抽取骨髓(高膽固醇飼料喂養(yǎng)半月后)，密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用含5％胎牛血清的EGM-2培養(yǎng)基及貼壁培養(yǎng)法誘導(dǎo)培養(yǎng)EPCs，探索EPCs分離條件及其接種密度。 3.光鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞在誘導(dǎo)分化過程中的形態(tài)變化是否具有內(nèi)皮祖細(xì)胞的特征。應(yīng)用內(nèi)皮祖細(xì)胞能吞噬 ac-LDL、結(jié)合UEA-1及表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性Ⅷ因子及FLK-1的特點(diǎn)，對(duì)其從

3、不同角度進(jìn)行鑒定。 4.LipofectamineTM2000介導(dǎo)PDNA3.1-Angl、PEGFP-N1-VGF165轉(zhuǎn)染EPCs，探索最佳轉(zhuǎn)染效率時(shí)細(xì)胞融合度、質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例。激光共聚焦顯微鏡及RT-PCR檢測基因Angl、VEGF165的表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀檢測VEGF165轉(zhuǎn)染EPCs的轉(zhuǎn)染率。CCK-8法觀察基因轉(zhuǎn)染對(duì)EPCs增殖力的影響。 5.制作日本大耳兔單側(cè)下肢急性缺血模型，于髂外動(dòng)脈起始部分離并切除

4、股淺動(dòng)脈，股骨遠(yuǎn)端水平離斷股動(dòng)脈，兔急性下肢缺血模型成功建立。觀察術(shù)后兔的跛行及下肢缺血壞死程度。 6.將下肢缺血的日本大耳兔隨機(jī)分為A、B、C、D組，缺血肢體肌肉注射各組EPCs。A組注射未轉(zhuǎn)染EPCs(EPCs組)；B組注射Angl轉(zhuǎn)染的EPCs(EPC/Angl)；C組注射VEGF165轉(zhuǎn)染的EPCs(EPC/VEGF)；D組聯(lián)合注射VEGF165轉(zhuǎn)染的EPCs及Angl轉(zhuǎn)染的EPCs(EPC/VEGF+EPC/Angl)

5、。移植術(shù)后50天行下肢CTA、DSA及超聲多普勒檢查，觀察缺血下肢側(cè)支循環(huán)及血流改善情況，計(jì)數(shù)毛細(xì)血管數(shù)，比較上述三種影像方法評(píng)價(jià)下肢缺血情況的敏感性及差異性。并取注射部位1cm3大小的股四頭肌或內(nèi)收肌做石蠟切片，進(jìn)行Ⅷ因子免疫組化染色，利用Ⅷ計(jì)算毛細(xì)血管密度，經(jīng)免疫組化染色的微血管呈棕黃色。 結(jié)果： 兔骨髓單個(gè)核細(xì)胞按4-5×105/c㎡密度接種到預(yù)先包被有纖維連接蛋白的六孔板上，誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后就有大量細(xì)胞貼壁，吸出

6、上層懸浮液離心后重新接種繼續(xù)培養(yǎng)，24h以內(nèi)的貼壁細(xì)胞棄掉。重新接種細(xì)胞于48h內(nèi)完成貼壁，接種后第4-5天細(xì)胞開始變形，第8天左右就有60％融合度，約10天左右就可以傳代，早期內(nèi)皮祖細(xì)胞呈梭形或多邊形，在培養(yǎng)過程中多次觀察到貼壁細(xì)胞首尾連接呈直線樣或腺腔樣結(jié)構(gòu)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道為內(nèi)皮祖細(xì)胞的特征性表現(xiàn)。第二代EPCs絕大部分能攝取ac-LDL，并結(jié)合UEA-1，雙陽性率在70％以上。第二代的EPCs的flk-1和Ⅷ因子免疫組化染色陽性率分別

7、為(95.0±3.2％)，(90.0±3％)，證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。 EGFP-N1-VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EPCs24h后激光共聚焦顯微鏡下觀察部分細(xì)胞表達(dá)EGFP而發(fā)出很強(qiáng)綠色熒光，部分細(xì)胞在板底熒光較弱，說明VEGF165轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染后48h流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染率達(dá)22.5％。RT-PCR在轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)檢測到VEGF165及Angl蛋白的強(qiáng)表達(dá)，而未轉(zhuǎn)染組未檢測到兩因子的表達(dá)。CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染PEGFP-N

8、1-VEGF165的EPCs增殖力提高，而轉(zhuǎn)染PDNA3.1-Angl的EPCs增殖力未見影響。流式及細(xì)胞形態(tài)觀察證實(shí)：細(xì)胞融合度在80％左右、脂質(zhì)體與質(zhì)粒比例為3：1時(shí)，轉(zhuǎn)染率較高，可達(dá)到20％-30％，且細(xì)胞活力仍較高。 移植術(shù)后50天，各組DSA、CTA、超聲多普勒及免疫組化顯示基因修飾后的EPCs組有較多的側(cè)支循環(huán)建立，其毛細(xì)血管數(shù)、血流增加值、毛細(xì)血管密度均明顯高于EPCs組，而以EPC/VEGF+EPC/Angl組最

9、高，EPC/VEGF組較EPC/Angl組高。各組(毛細(xì)血管數(shù)、血流增加值、毛細(xì)血管密度)間比較均有顯著性差異(P<0.01)，DSA較CTA對(duì)新生血管顯示更清晰，各處理組內(nèi)對(duì)兩種檢查結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EPCs組組織壞死率最高，EPC/VEGF+EPC/Angl組最低。 結(jié)論： 1.聯(lián)合密度梯度離心法及貼壁培養(yǎng)分離法可在體外成功獲得骨髓EPCs。 2.綜合細(xì)胞形態(tài)觀察、熒光細(xì)胞化

10、學(xué)染色及免疫組化染色檢測可證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為EPCs。 3.脂質(zhì)體介導(dǎo)的PDNA3.1-Angl、PEGFP-N1-VEGF165質(zhì)粒能成功轉(zhuǎn)染EPCs，當(dāng)細(xì)胞融合度為80％左右、脂質(zhì)體與質(zhì)粒比例為3：1時(shí)，轉(zhuǎn)染率較高，可達(dá)到20％-30％，且細(xì)胞活力較高。 4.VEGF165、Angl基因轉(zhuǎn)染EPCs后，VEGF165能刺激EPCs增殖；而Ang-1對(duì)EPCs增殖力無明顯影響。 5.移植基因修飾后的EPCs組比未轉(zhuǎn)