Photofrin-Herceptin偶聯(lián)物對(duì)腫瘤細(xì)胞株的體外殺傷效應(yīng)研究.pdf

1、【目的】研究Photofrin-Herceptin偶聯(lián)物對(duì)HER-2表達(dá)陽性腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用，為進(jìn)一步的光免疫治療奠定基礎(chǔ)。 【方法】1.分別對(duì)SK-BR-3、MCF-7、A549三種腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各細(xì)胞株細(xì)胞表面HER-2表達(dá)率； 2.將131I-Herceptin超濾，用紙層析進(jìn)行組分分析以驗(yàn)證超濾法去除商品Herceptin中所含賦形劑及防腐劑的可行性； 3.將商品Herc

2、eptin用超濾法進(jìn)行預(yù)處理，用碳二亞胺(EDCI)將光敏劑Photofrin與單抗Herceptin偶聯(lián)，并用薄層層析對(duì)Photofrin-Herceptin偶聯(lián)物進(jìn)行鑒定，然后分別使用凝膠過濾、超濾、鹽析及親和層析的方法對(duì)Photofrin-Herceptin偶聯(lián)物的純化進(jìn)行嘗試； 4.用酶聯(lián)免疫法測(cè)定Photofrin-Herceptin偶聯(lián)物免疫活性，并用MTT法檢測(cè)其對(duì)不同HER-2表達(dá)率的腫瘤細(xì)胞株的體外殺傷作用。

3、 【結(jié)果】1.傳代培養(yǎng)的SK-BR-3、MCF-7、A549細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，其在普通光鏡下的照片與ATCC提供的照片相比無明顯差異。流式細(xì)胞術(shù)(本院血液科實(shí)驗(yàn)室)測(cè)定SK-BR-3細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞表面HER-2表達(dá)率，分別為：99.04％、7.55％和0.44％。 2.131I-Herceptin超濾前Rf值=0的百分?jǐn)?shù)為77.1％，與總的截留率78.2％相近，說明131I標(biāo)記的Herceptin通過超

4、濾，截留液中基本上只有被131I標(biāo)記的單抗了，原液中其它成分幾乎都被濾走。Rf值=0.1和0.2時(shí)，所占總放射性活度百分比為2.2，為小分子物質(zhì)結(jié)合131I所致。超濾后截留液紙層析結(jié)果，Rf值=0的百分?jǐn)?shù)為96.8％，顯示截留液中成分比較單一，超濾除雜效果滿意。對(duì)比兩次超濾后的濾過液紙層析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，濾過液中所含絕大部分為游離131I及與131I結(jié)合的小分子化合物，真正大分子化合物極少，體現(xiàn)超濾的截留效果較好。 3.薄層層析結(jié)

5、果顯示：Herceptin位于原點(diǎn)，普通燈光下無色，紫外燈下呈藍(lán)色，Rf值接近于0；Photofrin在普通燈光下顯示一紅色長(zhǎng)帶，從原點(diǎn)一直拖到10cm處，遠(yuǎn)處較深；Photofrin-Herceptin偶聯(lián)物溶液在普通燈光下也顯示紅色條帶，但主要集中在原點(diǎn)，紫外燈下原點(diǎn)呈藍(lán)色。 4.用葡聚糖凝膠SephadexG-25做為分離基質(zhì)不能去除偶聯(lián)物中游離的Photofrin，Photofrin可能與SephadexG-25發(fā)生結(jié)合

6、，95％的乙醇清洗層析柱時(shí)出現(xiàn)填料溶解現(xiàn)象。超濾純化法顯示Photofrin水溶液基本上不能透過截留分子量30,000的超濾膜。鹽析結(jié)果顯示在50％飽和硫酸銨溶液中Photofrin可以同蛋白質(zhì)一樣析出，而向這種析出液中加入少量醇溶液后，可以使液體變得澄清。親和層析的結(jié)果顯示Photofrin容易與proteinG結(jié)合，并且在洗脫液的作用下發(fā)生了產(chǎn)氣化學(xué)反應(yīng)。 5.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)顯示Photofrin-Herceptin偶聯(lián)物

7、的免疫活性較Herceptin降低，前者約為后者的50％。 6.體外殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在所含光敏劑和/或單抗劑量相同的條件下，Photofrin-Herceptin偶聯(lián)物對(duì)SK-BR-3細(xì)胞的殺傷作用明顯強(qiáng)于Photofrin，Herceptin，Photofrin+Herceptin組(p＜0.05)；Herceptin對(duì)細(xì)胞幾乎沒有殺傷作用，但光鏡下可見其對(duì)于SK-BR-3細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)有明顯影響；單用Photofrin或P

8、hotofrin和Herceptin的混合物，兩條細(xì)胞存活率曲線幾乎重合(p＞0.05)，表明Photofrin+Herceptin對(duì)細(xì)胞的殺傷作用是由Photofrin所發(fā)揮的，其中的Herceptin基本沒有影響Photofrin的作用；Photofrin-Herceptin偶聯(lián)物對(duì)該細(xì)胞株的IC50約為1.5μg/ml，Photofrin+Herceptin的IC50約為6.μg/ml，它們的IC50之比為0.23，可見Photo

9、frin-Herceptin偶聯(lián)物對(duì)該細(xì)胞株的殺傷作用較偶聯(lián)前明顯增強(qiáng)。 Photofrin-Herceptin偶聯(lián)物對(duì)MCF7細(xì)胞的殺傷作用略強(qiáng)于P和P+H組(p＜0.05)，P組與P+H組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。結(jié)果顯示Herceptin對(duì)該細(xì)胞株沒有殺傷作用，Photofrin-Herceptin偶聯(lián)物對(duì)該細(xì)胞株的IC50約為6.00μg/ml，Photofrin+Herceptin的IC50約為6.μg/m

10、l，兩者IC50之比為0.91，可見偶聯(lián)物對(duì)MCF-7細(xì)胞株(HER-2±)的殺傷作用較偶聯(lián)前略有增強(qiáng)，但與HER-2表達(dá)強(qiáng)陽性的SK-BR-3細(xì)胞株相比明顯降低。 Photofrin-Herceptin偶聯(lián)物對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用與Photofrin和Photofrin+Herceptin組無顯著差異-(p＞0.05)，而各實(shí)驗(yàn)組與Herceptin組相比都有顯著性差異(p＜0.05)。結(jié)果顯示Herceptin對(duì)于A549

11、細(xì)胞株亦無明顯殺傷作用，光鏡下細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好;Photoffin-Herceptin、Photofrin+Herceptin、Photofrin對(duì)該細(xì)胞株的IC50均約為5.0μg/ml左右，Photofrin-Herceptin與Photofrin+Herceptin之間的IC50比值接近1.0?？梢?，對(duì)于HER-2表達(dá)陰性的A549細(xì)胞株，Photofrin-Herceptin偶聯(lián)物對(duì)其殺傷作用較偶聯(lián)前無明顯差異。結(jié)合前兩項(xiàng)結(jié)果，

12、可以認(rèn)為Photofrin-Herceptin偶聯(lián)物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用具有特異性。另外，從Photofrin對(duì)上述三種細(xì)胞株不同的IC50可以看出，不同細(xì)胞株對(duì)Photofrin的敏感性不同。 【結(jié)論】1.SK-BR-3、MCF-7、A549三種腫瘤細(xì)胞株的HER-2表達(dá)率符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，可以用于本實(shí)驗(yàn)。 2.用超濾的方法對(duì)商品Herceptin進(jìn)行預(yù)處理，可以基本去除其中所含的賦形劑及防腐劑成分，從而避免或減少了其

13、對(duì)偶聯(lián)過程的影響。 3.用碳二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)切實(shí)有效，但Photofrin-Herceptin偶聯(lián)物免疫活性較偶聯(lián)前有所下降。 4.Photofrin-Herceptin偶聯(lián)物對(duì)HER-2表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞的殺傷作用較Photofrin、Herceptin及Herceptin與Photofin的混合物明顯增強(qiáng)，對(duì)于HER-2表達(dá)陰性的腫瘤細(xì)胞殺傷效果無明顯差異，其殺傷作用具有特異性和靶向性，存在進(jìn)一步光免疫治療的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)