雷公藤多甙聯(lián)合丹參酮ⅡA對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠心血管損傷的保護(hù)作用及機(jī)制探討.pdf

1、目的：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)破壞為主要表現(xiàn)的慢性系統(tǒng)性自身免疫病。近年來，隨著免疫抑制劑和生物制劑的廣泛應(yīng)用，RA患者生存期不斷延長，心血管并發(fā)癥的發(fā)生率與死亡率呈不斷上升的趨勢。因此探討RA合并心血管損傷的發(fā)病機(jī)理及防治措施成為RA臨床治療中亟待解決的重要問題之一，具有重要的臨床意義。本課題擬通過觀察雷公藤多甙(tripterygium glycosides，TG)聯(lián)合丹參酮Ⅱ A(

2、tanshinone Ⅱ A，Tan Ⅱ A)對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠血清腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-a，TNF-α)、血管假性血友病因子(vonWillebrand Factor，vWF)水平，離體血管內(nèi)皮依賴性舒張功能和內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)所致收縮功能以及主動脈內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric

3、 oxide synthase，eNOs)和內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)蛋白表達(dá)的影響，探討中藥有效成分配伍對RA心血管損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：選擇體重120-140g的Wistar大鼠，雌雄各半。測量雙側(cè)足爪厚度后常規(guī)消毒，于大鼠背部、尾根部、右足爪部多點(diǎn)注射雞Ⅱ型膠原溶液，建立CIA大鼠模型。于造模14天相同方法進(jìn)行第2次免疫。另取8只大鼠注入等量生理鹽水作為空白對照組。

4、每周測量關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)。第21天將AI值大于5并出現(xiàn)2次反應(yīng)的大鼠隨機(jī)分為模型組、甲氨喋呤組(MTX組)、雷公藤多甙組(TG組)、雷公藤多甙+丹參酮IIA組(TG+Tan IIA組)、丹參酮IIA組(Tan IIA組)，每組8只。當(dāng)日測量大鼠體重，用游標(biāo)卡尺測量各組大鼠足爪厚度。各治療組連續(xù)灌胃給藥(模型組灌胃給予等量生理鹽水)27天，給藥結(jié)束后第2天測量各組大鼠體重、足爪厚度，4％水合氯醛麻醉，腹主

5、動脈取血，留取血清，ELISA法測定血清TNF-α、vWF。取血后立即打開胸腔，截取長為3-4mm的主動脈環(huán)，應(yīng)用主動脈環(huán)浴皿法檢測各組內(nèi)皮依賴性舒張功能并分別給予濃度為3、10、20、40nmol/L的ET-1觀察血管收縮功能的變化。剩余部分主動脈固定、脫水、包埋進(jìn)行HE染色，用免疫組織化學(xué)法測定ET-1、eNOs的表達(dá)并進(jìn)行半定量分析。統(tǒng)計學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS for windows 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，所得數(shù)據(jù)

6、均以X±S表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。 結(jié)果： 1.TG+ Tan IIA對CIA大鼠一般情況的影響造模21天后，除空白對照組外，各組大鼠背部、尾根部出現(xiàn)類風(fēng)濕結(jié)節(jié)，AI值均大于5，造模側(cè)與對側(cè)足爪腫脹明顯。各組體重明顯低于空白對照組(P＜0.01)，但MTX組、TG組、TG+Tan II A組、Tan IIA組間無差異(P＞0.05)；灌胃完畢，模型組、MTX組、TG組、Tan IIA組體重明顯低于空白對照

7、組(P＜0.01.)，TG+Tan IIA組體重低于空白對照組(P＜0.05)，其中模型組體重明顯低于MTX組、TG組(P＜0.01)，模型組體重與Tan IIA組無差別(P＞0.05)，MTX組、TG組相比無差別(P＞0.05)。 2.TG+Tan Ⅱ A對CIA大鼠足爪腫脹的抑制作用給藥4周后，MTX組、TG+Tan Ⅱ A組造模側(cè)足爪平均腫脹度明顯低于模型組和Tan Ⅱ A組(P＜0.01)，TG組低于模型組和Tan Ⅱ

8、A組(P＜0.05)，MTX組、TG組、TG+Tan Ⅱ A組比較無明顯差異(P＞0.05)，但TG+Tan Ⅱ A組抑制率優(yōu)于MTX組、TG組(46.44％VS 40.46％、33.90％)，Tan Ⅱ A組與模型組無明顯差別(P＞0.05)。MTX組、TG組、TG+Tan ⅡA組非造模側(cè)足爪厚度無明顯差異，且均低于模型組和TanⅡA組(P＜0.01)，但TG+Tan ⅡA組抑制率優(yōu)于MTX組、TG組(46.33％VS 42.30％、

9、41.39％)。 3.TG+Tan IIA對CIA大鼠內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響CIA大鼠主動脈環(huán)給予乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)后內(nèi)皮依賴性舒張作用明顯降低。與空白對照組相比，模型組，MTX組，TG組血管環(huán)應(yīng)用Ach后對去甲腎上腺素(noradrenaline，NA)引起血管收縮反應(yīng)的舒張率顯著降低(P＜0.01、0.05)，TG+Tan Ⅱ A組、Tan Ⅱ A組與空白對照組比較無明顯差別(P＞0.05)。

10、 4 TG聯(lián)合TanⅡA對ET-1所致離體血管收縮的拮抗作用空白對照組離體血管環(huán)給予小劑量ET-1(3nmol/L)可引起短時間收縮，繼而引起血管舒張，舒張率為67.26±12.59％，TG+Tan Ⅱ A組也有同樣作用，舒張率為26.75±15.44％，其他組ET-1小劑量給藥則無明顯舒張作用。各組離體血管環(huán)在10、20nmol/L時收縮值持續(xù)增加達(dá)到高峰，10、20 nmol/L時模型組、MTX組、TG組與空白對照組有顯著性差

11、異(P＜0.01)，TG+Tan Ⅱ A組、Tan Ⅱ A組與空白對照組無差別(P＞0.05)，但TG+Tan ⅡA組作用優(yōu)于Tan ⅡA組，MTX組、TG組在10、20nmol/L時收縮值均低于模型組(P＜0.05)，40nmol/L時各組收縮值增加不明顯。 5 TG+Tan ⅡA對CIA大鼠血清TNF-α、vWF變化的影響 5.1 TG+Tan ⅡA血清TNF-α的影響(Pg/ml)模型組、Tan ⅡA組水平明顯高于

12、空白對照組(P＜0.01)，Tan ⅡA組水平低于模型組(P＜0.01)。MTX組、TG組與TG+Tan ⅡA組則與空白對照組無差異(P＞0.05)，三者之中，TG+Tan ⅡA組TNF-α水平最低(27.29±6.36)，TG組稍高于MTX組(36.50±14.88 VS 33.43±13.45)。 5.2 TG+Tan ⅡA對血清vWF的影響(mU/ml)模型組vWF水平最高，與空白對照組、MTX組、TG組、TG+Tan Ⅱ

13、A組、Tan ⅡA組差異具有顯著性(P＜0.01、0.05)，空白對照組、MTX組、TG組、TG+Tan ⅡA組、Tan ⅡA組各組vWF水平無差異(P＞0.05)，但TG+Tan ⅡA組、Tan ⅡA組vWF水平稍低于MTX組、TG組。 6 動脈內(nèi)皮HE染色及ET-1、eNOs表達(dá)的比較高倍鏡下主動脈HE染色顯示，模型組內(nèi)皮連續(xù)性較差，并伴有脂質(zhì)沉積，泡沫細(xì)胞形成，符合動脈粥樣硬化第二期改變，MTX組、TG組、Tan ⅡA組僅

14、有少量單核細(xì)胞聚集，TG+Tan ⅡA組與空白對照組內(nèi)皮完整，連續(xù)性好，無病理改變。 ET-1半定量分析：模型組明顯高于空白對照組，差異有顯著性(P＜0.01)、MTX組、TG組、Tan ⅡA組高于空白對照組和TG+Tan ⅡA組(P＜0.05)，空白對照組、TG+Tan ⅡA組相比無明顯差異(P＞0.05)；eNOS半定量分析：模型組、MTX組、TG組、Tan ⅡA組明顯低于空白對照組(P＜0.01)，模型組低于MTX組、TG

15、組、Tan ⅡA組(P＜0.05)，空白對照組、TG+Tan ⅡA組相比無明顯差異(P＞0.05)。 結(jié)論： 1、CIA大鼠存在心血管損傷的相關(guān)因素，CIA大鼠血清TNF-α、vVCF水平升高，離體主動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能明顯下降并且對ET-1敏感性增高，主動脈內(nèi)膜連續(xù)性差，泡沫細(xì)胞形成，主動脈eNOS表達(dá)減少而ET-1表達(dá)增強(qiáng)。 2、雷公藤多甙聯(lián)合丹參酮ⅡA具有抗炎增效作用，兩者聯(lián)合可明顯降低CIA大鼠足爪厚度