呋喃丹和百菌清對斑馬魚酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)調(diào)控的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、農(nóng)藥對生物體細(xì)胞糖類、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的代謝均能產(chǎn)生毒性效應(yīng),可通過改變下丘腦-垂體-腎上腺軸激素、激活自主神經(jīng)系統(tǒng)、細(xì)胞因子和神經(jīng)內(nèi)分泌免疫軸激素的水平使機(jī)體進(jìn)入應(yīng)激狀態(tài)。酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TAT,EC2.6.1.5)廣泛存在于生物體中,是酪氨酸降解過程的限速酶,參與糖異生過程。TAT轉(zhuǎn)錄受多種糖代謝相關(guān)激素調(diào)控,糖皮質(zhì)激素和胰高血糖素可誘導(dǎo)TAT的表達(dá),而胰島素則抑制TAT的轉(zhuǎn)錄激活。TAT作為糖皮質(zhì)激素等的靶基因和糖異生的關(guān)鍵酶,農(nóng)藥暴露

2、可能對TAT的表達(dá)調(diào)控產(chǎn)生影響,從而影響機(jī)體糖代謝水平。
　　本文以斑馬魚(Danio rerio)為研究對象,克隆獲得到了斑馬魚TAT基因的cDNA全長序列,根據(jù)對某地市場蔬菜長達(dá)一年的農(nóng)藥殘留監(jiān)測結(jié)果,選擇有檢出的呋喃丹和百菌清進(jìn)行斑馬魚暴露試驗(yàn),研究其對TAT的mRNA、蛋白和酶活性水平以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響,以探討農(nóng)藥對斑馬魚TAT表達(dá)調(diào)控的作用及其對糖代謝的影響。
　　(1)本文首先利用 RT-PCR和 RACE技術(shù)獲

3、得到了斑馬魚 TAT基因的cDNA全長序列(2049 bp),其開放閱讀框(1407 bp)可編碼468個(gè)氨基酸的蛋白(分子量為51.7 kDa)。通過該蛋白序列與已知的17個(gè)物種的TAT蛋白比對分析,發(fā)現(xiàn)與其它硬骨魚TAT蛋白序列的相似性最高,達(dá)到76.6-86.0％。利用PHYLIP3.5c軟件包NJ法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹,該蛋白序列與魚類 TAT聚在一起,符合同分支物種蛋白聚在一起的規(guī)律。采用Real-time PCR技術(shù)進(jìn)行時(shí)空表達(dá)

4、分析,發(fā)現(xiàn)斑馬魚TAT主要在肝臟中表達(dá),仔魚孵化后的轉(zhuǎn)錄活性顯著增強(qiáng)。與哺乳動物相似的時(shí)空表達(dá)特征說明斑馬魚TAT可能具有與哺乳動物TAT相似的功能。
　　(2)本文對某地市場在售蔬菜進(jìn)行了1年的農(nóng)藥殘留監(jiān)測,共檢測樣品2983個(gè),發(fā)現(xiàn)呋喃丹從0.0066μg·kg-1至8.5914μg·kg-1均有檢出,百菌清從0.0127μg·kg-1至63.4543μg·kg-1均有檢出,表明這2種農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中正在使用。目前,關(guān)于這2種

5、農(nóng)藥對TAT表達(dá)調(diào)控影響的研究較少。因此,本文選擇這2種農(nóng)藥用于斑馬魚毒性暴露實(shí)驗(yàn)。
　　將斑馬魚暴露于10、30、50、100、200、500μg·L-1的呋喃丹中4 h,30μg·L-1以上暴露組即可檢測到TAT mRNA表達(dá)量顯著降低,并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系;50μg·L-1呋喃丹中暴露1、2、4、8、12、24h,TAT mRNA表達(dá)量4 h即顯著降低,呈現(xiàn)時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。暴露在5、7.5、10、15、20、30μg·L-1的百

6、菌清中8h,濃度達(dá)到10μg·L-1以上即可檢測到TAT mRNA表達(dá)量顯著降低,但沒有劑量效應(yīng)關(guān)系;采用15μg·L-1百菌清中暴露2、4、6、8、12、24 h,TAT mRNA表達(dá)量在8 h開始顯著降低,也未呈現(xiàn)時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。將斑馬魚暴露在濃度為50μg·L-1的呋喃丹中4 h或15μg·L-1的百菌清中8 h,通過Western blot和酶活性測定發(fā)現(xiàn)單位肝重TAT蛋白表達(dá)量和TAT酶活性均比對照組顯著降低,降幅均在50%左右

7、。研究結(jié)果表明呋喃丹和百菌清均可顯著抑制斑馬魚肝臟TAT的轉(zhuǎn)錄活性,由于TAT轉(zhuǎn)錄受到抑制導(dǎo)致蛋白含量和TAT的酶活性顯著降低。
　　(3)本文檢測了生長激素(GH)和甲狀腺激素T4對斑馬魚TAT表達(dá)的影響。通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)證實(shí)GH及T4能夠刺激斑馬魚TAT的表達(dá),克隆獲得了斑馬魚TAT基因的啟動子序列(1575 bp),分析發(fā)現(xiàn)存在3個(gè)潛在的STAT5結(jié)合位點(diǎn),推測GH可能是通過STAT5結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控斑馬魚肝臟TAT的表達(dá)

8、。
　　研究了呋喃丹和百菌清對斑馬魚GH、T4以及糖代謝相關(guān)激素的影響,并觀察了血糖、肝糖原水平以及乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的變化。將斑馬魚暴露在濃度為50μg·L-1的呋喃丹中4 h或15μg·L-1的百菌清中8 h后,皮質(zhì)醇含量顯著降低,胰島素和胰高血糖素水平均升高,呋喃丹導(dǎo)致GH和T4顯著上升,而百菌清對二者無顯著影響;斑馬魚肝糖原含量顯著下降,而血糖未出現(xiàn)顯著變化;斑馬魚AChE活性未受到顯著抑制?？梢娹r(nóng)藥暴露降低了糖