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文檔簡介
1、目的:觀察NMDA受體亞單位1、2A、2B在早期培養(yǎng)的人胚腦神經(jīng)干細胞中的表達變化。使用一定劑量的NMDA初步探討NMDA受體對hNSCs凋亡、增殖的影響。籍以填補hNSCs生物學研究中有關NMDA受體發(fā)育和作用方面的空白。 方法: 1.從正常流產(chǎn)人10~12周胚胎海馬分離培養(yǎng)、誘導分化、鑒定人胚腦神經(jīng)干細胞(Human neural stem cells,hNSCs),血清誘導分化后,用Nestin、β-ⅢTubuli
2、n、GFAP免疫細胞化學反應鑒定細胞性質(zhì)和類型。 2.取原代、一代和二代處于指數(shù)生長期的hNSCs,通過免疫細胞化學反應、RT-PCR和Western-blot等方法觀察NMDA受體亞單位1、2A、2B(N+Methyl-D-Aspartate receptor subunits 1、2A、2B,NR1、NR2A、NR2B)mRNA和蛋白質(zhì)的表達變化。 3.取傳代培養(yǎng)的hNSCs隨機分組:①正常組;②1μM NMDA組;
3、③10μMNMDA組;④30μM NMDA組;⑤100 μMNMDA組。每組取4孔,然后加入NMDA,放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),3天換液。各組在相應時間點,用Hoechst33258進行熒光染色,計算出凋亡率,實驗重復3次,以觀察NMDA受體對hNSCs凋亡的影響。 4.取傳代培養(yǎng)的hNSCs隨機分組:①正常組;②1μMNMDA組;③10μMNMDA組;④30μMNMDA組;⑤100μ MNMDA組。每組取8孔,然后加入NMDA,放
4、在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),3天換液。各組在相應時間點,用MTT法測定各孔光密度(OD)值,實驗重復3次,以研究NMDA受體對hNSCs增殖的影響。 結果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示(mean±SD),Western blot數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,多個實驗組與一個對照組比較采用最小顯著差法(LSD),實驗組之間比較采用q檢驗。凋亡率數(shù)據(jù)先用arcsin平方根P轉(zhuǎn)換后進行方差齊性檢驗,然后行單因素方差分析。以
5、P<0.05表示在統(tǒng)計學上有顯著性差異,P<0.01表示在統(tǒng)計學上有極顯著差異。 結果: 1.培養(yǎng)的細胞Nestin反應陽性,加入血清誘導分化后,細胞可以分別分化成β-ⅢTubulin、GFAP陽性的細胞,表明分離培養(yǎng)的是hNSCs。 2.hNSCs在原代、一代和二代時,NMDA受體亞單位NR1、NR2A、NR2B免疫細胞化學反應均呈陽性,且肉眼觀察無明顯差別:RT-PCR結果提示三種亞單位在不同的時間點mRNA
6、皆穩(wěn)定表達;Western-blot結果顯示,三種亞單位在不同的時間點各自蛋白的表達量基本一致。 3.在3天、7天、12天時,各實驗組神經(jīng)干細胞的凋亡率與正常組相比無明顯差異。 4.在NMDA作用3天和7天時,100 μ M組的OD值與正常組相比出現(xiàn)明顯增加(p<0.05),其它各組與正常組相比無明顯變化,而且各實驗組間也無明顯變化。NMDA作甩12天時,30 μ M和100 μ M組的OD值與正常組相比均明顯增加(p<
7、0.05),其它各組與正常組比較無明顯增加,而且30 μM和100 μM組間也無明顯差別。 結論: 1.從人胚腦海馬中分離出的神經(jīng)干細胞,在培養(yǎng)早期就有NMDA受體亞單位NR1、NR2A、NR2B的表達。 2.1 μ M、10 μ M、30 μ M和100 μ M的NMDA對hNSCs的凋亡無明顯影響,提示hNSCs對興奮性毒素有較好的耐受性。 3.30 μ M和100 μ M的NMDA使hNSGs/的M
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