三參方對(duì)慢性萎縮性胃炎大鼠胃組織細(xì)胞凋亡和相關(guān)調(diào)控基因的影響.pdf

1、目的:三參方(由黨參、丹參、玄參、黃連、清半夏、炒白芍、炙甘草、陳皮、炒白術(shù)組成)具有益氣養(yǎng)陰,扶助中州等功效,經(jīng)臨床觀察證明,對(duì)慢性萎縮性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)具有較好的治療效果,為了進(jìn)一步探討其作用機(jī)制,參照相關(guān)文獻(xiàn)采用0.2％的脫氧膽酸鈉溶液及50℃熱水給大鼠灌胃,并結(jié)合饑飽失常的綜合法復(fù)制CAG大鼠模型,同時(shí)施加藥物干預(yù),通過(guò)觀察其對(duì)CAG大鼠血清GAS、血漿MTL、血清SOD和MD

2、A含量的影響,探討其改善胃功能方面的作用機(jī)制;通過(guò)觀察其對(duì)胃組織細(xì)胞凋亡及相關(guān)調(diào)控基因Caspase3、Bcl-2、Fas表達(dá)的影響,探討其抗胃組織細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制;并運(yùn)用HE染色方法觀察該方對(duì)胃組織形態(tài)學(xué)的影響。
　　 方法:
　　 選用Wistar大鼠60只,自由飲水進(jìn)食,飼養(yǎng)于18℃～22℃明暗各12小時(shí)的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi),正常喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為6組,每組10只。具體分組情況如下:(1)正常對(duì)照組(簡(jiǎn)稱正常組

3、,normalcontrol group,N);(2)模型對(duì)照組(簡(jiǎn)稱模型組,model group,M);(3)三參方低劑量組(簡(jiǎn)稱低劑量組,low-dose Prescription Sanshen group,L);(4)三參方高劑量組(簡(jiǎn)稱高劑量組,high-dose Prescription Sanshengroup,H);(5)陽(yáng)性藥(維霉素)對(duì)照組(簡(jiǎn)稱維霉素組,W);(6)陽(yáng)性藥(三九胃泰)對(duì)照組(簡(jiǎn)稱三九胃泰組,S)。

4、動(dòng)物造模參照相應(yīng)文獻(xiàn)以0.2％的脫氧膽酸鈉溶液灌胃,1.5ml/只/d,與脫氧膽酸鈉溶液灌胃間隔5h,用50℃熱水2ml/只/d灌胃,并且加用饑飽失常(即2d喂食,保證足量,1d停食),正常組大鼠給予相應(yīng)等量的蒸餾水,普通飼料喂養(yǎng),自由飲水,持續(xù)造模共8周。第九周開(kāi)始各組分別給與相應(yīng)的藥物灌胃,給藥劑量按藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)計(jì)算,三參方高、低劑量組分別按3.67g/kg、1.83g/kg體重的標(biāo)準(zhǔn)灌服,兩個(gè)對(duì)照組均按1g/kg體重的標(biāo)準(zhǔn)灌服,

5、正常組和模型組大鼠均灌服等量的蒸餾水。各組1次/d灌胃,每次用藥體積均按1ml/100g計(jì)算。給藥9周末,于最后1次給藥禁食12h后麻醉狀態(tài)下股動(dòng)脈取血,分離血漿,密封,-20℃冷存以備檢測(cè)GAS、MTL、SOD和MDA的含量。同時(shí)迅速剖開(kāi)腹部,分離胃組織,沿胃竇近幽門(mén)口至胃大彎方向取少許胃組織,生理鹽水洗凈血液,濾紙吸干水分,放置于70％乙醇溶液中,4℃冰箱冷貯,再取0.5cm×0.5cm大小的組織塊,用4％的多聚甲醛固定,以備HE染

6、色進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。取已固定的胃組織放于100目不銹鋼網(wǎng)上,下置一平皿,用眼科剪刀將組織剪碎至1mm3大小,用眼科鑷子輕輕搓組織塊,邊搓邊以PBS液沖洗,直至將組織搓完。將平皿中的混懸液用300目篩網(wǎng)過(guò)濾去除細(xì)胞團(tuán)塊,收集細(xì)胞懸液,500～800r/min離心2min,棄上清,保留沉淀,加入PBS0.3ml,稀釋混勻后,將單細(xì)胞懸液分成3份,調(diào)整每份樣品的細(xì)胞數(shù)為1×106,分別用于檢測(cè)胃組織細(xì)胞增殖與凋亡及相關(guān)調(diào)控基因Caspase

7、3、Fas和Bcl-2蛋白表達(dá)。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1：各組大鼠胃組織形態(tài)學(xué)的變化
　　 正常組大鼠胃黏膜厚度正常,上皮完整,腺體排列整齊,固有腺體及黏膜層毛細(xì)血管無(wú)擴(kuò)張,未見(jiàn)炎癥反應(yīng)。細(xì)胞呈單層柱狀,腺上皮和腺管分界清楚。模型組大鼠上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落,腺體有不同程度的萎縮,黏膜下小血管清晰可見(jiàn),間質(zhì)內(nèi)有大量炎性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。各治療組大鼠胃黏膜均有不同程度的改

8、善,三九胃泰治療組上皮細(xì)胞部分變性、脫落,腺體排列比模型組整齊,有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。維霉素治療組胃黏膜有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),好于模型組。低劑量組腺體排列較整齊,紊亂程度變化較模型組輕。高劑量組胃黏膜結(jié)構(gòu)較清晰,上皮排列整齊,細(xì)胞無(wú)明顯變性壞死,腺體大小形態(tài)較一致,基本接近正常組。
　　 2：各組大鼠血清GAS和血漿MTL含量的變化
　　 模型組大鼠的血清GAS和血漿MTL的含量較正常組明顯下降(P＜0.01)。經(jīng)藥物治療后

9、,各治療組與模型組比較,GAS和血漿MTL的含量明顯升高,均優(yōu)于模型組,有顯著性差異(P＜0.01或P＜0.05);高劑量組與其他治療組比較,GAS和血漿MTL的含量明顯升高,有顯著性差異(P＜0.01或P＜0.05);其他治療組之間比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　 3：各組大鼠血清SOD和MDA含量的的變化
　　 模型組大鼠的血清SOD的含量較正常組明顯下降,有顯著性差異(P＜0.01),MDA的含量較正常組明

10、顯升高,有顯著性差異(P＜0.01)。經(jīng)藥物治療后,各治療組血清SOD含量均高于模型組,有顯著性差異(P＜0.01),血清MDA的含量均低于模型組,有顯著性差異(P＜0.01);其中高劑量組血清SOD含量高于其他治療組,而血清MDA的含量低于其他治療組,有顯著性差異(P＜0.01或P＜0.05);低劑量組血清MDA的含量低于三九胃泰組,有顯著性差異(P＜0.05);其他治療組之間比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　 4：各組

11、大鼠胃組織細(xì)胞凋亡率的變化
　　 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:模型組AI值比正常組明顯升高,有顯著性差異(P＜0.01)。經(jīng)藥物治療后,各治療組AI值均比模型組明顯下降,有顯著性差異(P＜0.05);其中,高劑量組AI值低于維霉素組和三九胃泰組,有顯著性差異(P＜0.01);低劑量組AI值低于維霉素組和三九胃泰組,有顯著性差異(P＜0.05);維霉素組和三九胃泰組之間比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 5：各組大鼠胃組織

12、細(xì)胞增殖周期的變化
　　 模型組大鼠G0/G1期細(xì)胞百分率較正常組升高(P＜0.01);G2/M期和S期細(xì)胞百分率均較正常組降低(P＜0.05)。經(jīng)用藥治療后,各治療組G0/G1期細(xì)胞百分率均低于模型組,有顯著性差異(P＜0.01);G2/M期和S期細(xì)胞百分率均高于模型組,有顯著性差異(P＜0.01或P＜0.05)。而各治療組之間比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 模型組PI值低于正常組,有顯著性差異(P＜0.01)

13、。經(jīng)用藥治療后,各治療組PI值均高于模型組,有顯著性差異(P＜0.01);而各治療組之間比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 6：各組大鼠胃組織細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白Caspase3、Fas和Bcl-2表達(dá)FI值的變化 模型組Caspase3和Fas蛋白表達(dá)FI值均高于正常組,而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)FI值低于正常組,有顯著性差異(P＜0.01或P＜0.05)。經(jīng)用藥治療后,各治療組Fas、Caspase3蛋白表達(dá)FI值均低于模型組

14、,而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)FI值均高于模型組,有顯著性差異(P＜0.01),有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01);其中,高、低劑量組的Caspase3蛋白表達(dá)FI值均低于維霉素組和三九胃泰組,有顯著性差異(P＜0.01或P＜0.05),而高、低劑量組之間比較未見(jiàn)顯著性差異(P＞0.05);高劑量組Fas蛋白表達(dá)FI值則低于低劑量組、維霉素組和三九胃泰組,有顯著性差異(P＜0.01或P＜0.05);各治療組的Bcl-2蛋白表達(dá)FI值比較

15、未見(jiàn)顯著性差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1：三參方可明顯改善CAG大鼠胃組織的病變程度,表現(xiàn)為用藥后各治療組大鼠胃組織細(xì)胞顆粒樣變性減輕或消失,胃組織纖維排列整齊,間質(zhì)無(wú)明顯擴(kuò)張充血,說(shuō)明本方對(duì)胃組織細(xì)胞具有保護(hù)作用。
　　 2：三參方能明顯增強(qiáng)大鼠胃功能,抗氧化損傷,表現(xiàn)為用藥后CAG大鼠的GAS、MTL、SOD均顯著升高,MDA顯著下降,說(shuō)明其能夠增強(qiáng)CAG大鼠胃的收縮和分泌功能和抗氧化損傷能力