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文檔簡介
1、南方醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文支原體在女性下生殖道中的分子流行病學(xué)研究姓名:欒瑞玲申請學(xué)位級別:碩士專業(yè):婦產(chǎn)科學(xué)指導(dǎo)教師:吳元赭20080501摘要本研究應(yīng)用PCRRFLP技術(shù),建立支原體的16SrDNA克隆文庫進(jìn)行RFLP分析,對普通女性人群陰道分泌物中的支原體進(jìn)行詳細(xì)分類。研究支原體在普通女性下生殖道中的定植情況與分型。調(diào)查人群包括女性健康體檢人群、孕早中期婦女以及婦科門診患者,明確支原體在這一人群中的流行病學(xué)情況,為進(jìn)一步研究支原體與
2、女性下生殖道疾病的關(guān)系提供理論依據(jù)。研究方法和過程:收集健康體檢女性、孕早中期婦女、以及普通婦科門診患者陰道分泌物190例。研究對象選取標(biāo)準(zhǔn):研究對象均有性生活史,在兩周內(nèi)未使用過任何抗生素,取樣三天內(nèi)沒有陰道沖洗、無陰道用藥及性生活,排除經(jīng)期女性。研究中收集到的陰道分泌物不經(jīng)傳統(tǒng)的培養(yǎng)法或是免疫法進(jìn)行初步篩選,而是直接用PCR法對分泌物進(jìn)行支原體檢測及分型,避免層層篩選造成的菌種丟失。這種應(yīng)用PCR方法對陰道分泌物直接進(jìn)行檢測的方法,
3、目前在國內(nèi)相關(guān)臨床研究中沒有廣泛開展,本研究嘗試應(yīng)用PCR—RFLP技術(shù),建立支原體的16SrDNA克隆文庫進(jìn)行RFLP分析,對普通女性人群陰道分泌物中的支原體進(jìn)行詳細(xì)分類。檢索美國GeneBank核酸數(shù)據(jù)庫中己登錄各種支原體科微生物16SrDNA基因序列,設(shè)計(jì)了16SrDNA引物對GPO和MGSO,其序列為:GPO3:5’GGGAGCAAACAGGAIvrAGArACCCT3’MGSO:5’TGCACCATCTGTCACTCTGTT_
4、AACCTC3’。支原體陽性樣本可以擴(kuò)增出約270bp的片段。電泳檢驗(yàn)270bp有條帶的樣品組的擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳回收,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用AluI和RsaI兩種限制性內(nèi)切酶消化,根據(jù)電泳產(chǎn)生的條帶,比對電子酶切的結(jié)果判斷支原體種類。為了驗(yàn)證結(jié)果的正確性,比對已經(jīng)鑒定的臨床株電泳結(jié)果,并根據(jù)酶切帶型的不同將轉(zhuǎn)化子分成不同的RFLP類型,每個RFLP類型中選取一定量的克隆子進(jìn)行測序。應(yīng)用Bioedit軟件將測序公司返回原序列
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