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文檔簡介
1、本文主要從以下幾個部分展開論述:
第一部分 結(jié)締組織生長因子和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2、蛋白激酶Cα在香煙煙霧暴露大鼠肺血管重構(gòu)中的表達(dá)變化
目的:探討在香煙煙霧暴露大鼠的肺血管中結(jié)締組織生長因子、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2和蛋白激酶Cα表達(dá)的變化,以及它們與香煙煙霧暴露大鼠肺血管重構(gòu)的關(guān)系。
方法:將24只健康雄性Wistar大鼠(8周齡)隨機(jī)平均分為4組:C組(對照組),S-1M組(香煙煙霧暴露1月組),
2、S-3M組(香煙煙霧暴露3月組)和S-6M組(香煙煙霧暴露6月組)。取動脈血檢測血氧分壓(PaO2),HE和平滑肌細(xì)胞α肌動蛋白染色觀察肺血管重構(gòu)情況,Western blotting檢測大鼠肺動脈平滑肌中 CTGF、PKCα和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)量。
結(jié)果:各組大鼠動脈血氧分壓之間比較無顯著性差異,隨著香煙煙霧暴露時間的延長,肺血管壁厚度和血管直徑的比值(%WT)、完全肌化血管比例、CTGF和p-ERK1/2、PKCα
3、的蛋白表達(dá)水平隨香煙煙霧暴露時間的延長而增加,各組間比較有顯著性差異(p﹤0.05)。CTGF和p-ERK1/2、PKCα的蛋白表達(dá)與大鼠的肺血管%WT和完全肌化血管比例呈正相關(guān)。
結(jié)論:香煙煙霧暴露大鼠的肺血管重塑隨暴露時間的延長而加重。同時,CTGF、活化的ERK1/2和PKCα在血管平滑肌中的表達(dá)隨暴露時間的延長而顯著增加,CTGF、ERK1/2的活化和PKCα可能與香煙煙霧暴露致大鼠肺血管重構(gòu)有關(guān)。
第二部分
4、 結(jié)締組織生長因子和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2、蛋白激酶Cα信號通路在香煙煙霧提取物致大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用及其之間的關(guān)系
目的:探討結(jié)締組織生長因子在香煙煙霧提取物致大鼠肺動脈平滑肌增殖過程中是否通過蛋白激酶Cα、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2信號通路參與調(diào)節(jié)。
方法:大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),應(yīng)用不同濃度(5、10、20、40、80μg/ml)的香煙煙霧提取物(CSE)刺激24小時,通過細(xì)胞計(jì)數(shù)評價細(xì)胞
5、增殖情況。1、將細(xì)胞分成5組:正常對照組(CM組),CSE組,NsiRNA組,CSE+NsiRNA組,CSE+CTGFsiRNA組,各組細(xì)胞同步化后用相應(yīng)的siRNA轉(zhuǎn)染,再給予CSE刺激;2、將細(xì)胞分成4組:正常對照組(CM組),CSE組,PD98059組,CSE+PD98059組,各組細(xì)胞同步化后需要的應(yīng)用PD98059預(yù)處理1小時,之后應(yīng)用CSE刺激。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)及BrdU摻入法檢測細(xì)胞增殖情況,分別采用real-time PCR
6、和Western blotting檢測各組CTGF、ERK1/2和PKCα的mRNA及蛋白表達(dá)。
結(jié)果:20μg/ml的CSE濃度對細(xì)胞的促增殖作用最強(qiáng),在CSE(20μg/ml)刺激下,CTGF和PKCα的mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高,大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖明顯;CTGFsiRNA除了明顯抑制CTGF的表達(dá)之外,PKCα的mRNA和蛋白表達(dá)和ERK1/2的活化也明顯受到抑制,CSE誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖也受到抑制;P
7、D98059可以抑制CSE刺激下ERK1/2的磷酸化及肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖,但是對CTGF mRNA和蛋白的表達(dá)沒有顯著影響。
結(jié)論:結(jié)締組織生長因子在香煙煙霧提取物刺激誘導(dǎo)的大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞異常增長的過程中,通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2和蛋白激酶Cα信號通路參與調(diào)節(jié)。
第三部分 結(jié)締組織生長因子和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2、蛋白激酶Cα信號通路在香煙煙霧致大鼠肺血管重構(gòu)中的作用及關(guān)系
目的:探討結(jié)締組
8、織生長因子在香煙煙霧暴露致大鼠肺血管重構(gòu)中是否通過蛋白激酶Cα、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2信號通路參與調(diào)節(jié)。
方法:構(gòu)建沉默大鼠CTGF表達(dá)的慢病毒,1、轉(zhuǎn)染大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞,將細(xì)胞分成5組:正常對照組(CM組),CSE組,LV-NsiRNA組,CSE+LV-NsiRNA組,CSE+LV-CTGFsiRNA組,各組細(xì)胞同步化后用轉(zhuǎn)染相應(yīng)的siRNA慢病毒載體,再給予CSE刺激;2、通過氣道給藥的方式用慢病毒感染大鼠,將大鼠分
9、成4組:正常對照組(controls組),煙霧暴露組(smoking組),煙霧暴露陰性病毒干預(yù)組(smoking+LV-NsiRNA組),煙霧暴露陽性病毒干預(yù)組(smoking+LV-CTGFsiRNA組),每組6只,各組大鼠根據(jù)不同情況進(jìn)行煙霧暴露和/或病毒感染,煙霧暴露時間為6周,分別應(yīng)用real-time PCR和Western blotting檢測各組大鼠肺血管CTGF、ERK1/2和PKCα的mRNA及蛋白表達(dá),通過HE染色和
10、平滑肌細(xì)胞α肌動蛋白染色觀察肺血管重構(gòu)情況。
結(jié)果:慢病毒成功轉(zhuǎn)染大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞,沉默CTGF表達(dá)的陽性慢病毒可以使CSE(20μg/ml)刺激下高表達(dá)的CTGF明顯受到抑制,大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖也顯著受到抑制,慢病毒構(gòu)建成功;各組大鼠在不同慢病毒感染和/或香煙煙霧暴露處理完成后處死,各組PaO2無顯著差異,和對照組比較,香煙煙霧暴露組CTGF和PKCα、p-ERK1/2表達(dá)升高,和香煙煙霧暴露陰性病毒感染組比較,香
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