內(nèi)源性FGF23對(duì)PTH促成骨細(xì)胞分化作用的影響.pdf

1、目的:
　　甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)的促成骨作用是其治療骨質(zhì)疏松癥的重要藥理基礎(chǔ)，然而對(duì)其促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的細(xì)胞基礎(chǔ)和影響因素等尚存爭議，其作用機(jī)制也未完全闡明。PTH有調(diào)節(jié)成纖維生長因子(fibroblast growthfactor, FGF)23表達(dá)的作用，而FGF23對(duì)成骨細(xì)胞分化和基質(zhì)礦化具有直接影響。細(xì)胞FGF23表達(dá)是否影響PTH的促成骨細(xì)胞分化作用等尚不明確。為此，本文利用體外

2、培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞，在觀察rhPTH1-34促成骨細(xì)胞分化的基礎(chǔ)上，采用RNA干擾技術(shù)沉默其FGF23的表達(dá)，研究內(nèi)源性FGF23對(duì)PTH促分化作用的影響。
　　方法:
　　1.采用酶消化法分離培養(yǎng)新生SD大鼠頭蓋骨成骨細(xì)胞，應(yīng)用堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)染色和體外礦化結(jié)節(jié)茜素紅(Alizarin Redstaining，ARS)染色進(jìn)行成骨細(xì)胞功能學(xué)鑒定。
　　2.為觀察PTH對(duì)成骨

3、細(xì)胞分化的作用，本文以重組人甲狀旁腺激素（recombinant human parathyroid hormone，rhPTH）1-34間隙循環(huán)加入作用3d，應(yīng)用PNPP法和MTT法檢測體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞總堿性磷酸酶(ALP)活性和細(xì)胞增殖率，分別以O(shè)D405nm/孔和OD570nm/孔表示，并以O(shè)D405nm/OD570nm計(jì)算細(xì)胞ALP比活性。為進(jìn)一步觀察rhPTH1-34對(duì)成骨細(xì)胞分化的時(shí)效作用，以10-9 mol/L rhP

4、TH1-34一次性給予后，分別于2h、8h和24 h連續(xù)取樣，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)分析成骨細(xì)胞ALP和骨鈣素(OCN) mRNA水平變化。
　　3.為明確PTH對(duì)成骨細(xì)胞FGF23表達(dá)的作用，本文采用10-9 mol/L rhPTH1-34一次性給予后，分別于2h、8h和24 h連續(xù)取樣，應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)觀察細(xì)胞FGF23轉(zhuǎn)錄水平變化。進(jìn)一步以10-9 mol/L rhPTH1

5、-34作用3d后，收獲細(xì)胞應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測胞內(nèi)FGF23蛋白水平。
　　4.為研究內(nèi)源性FGF23在PTH促成骨細(xì)胞分化中的作用，本文采用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)，以大鼠成骨細(xì)胞FGF23 mRNA213～235位點(diǎn)為靶序列設(shè)計(jì)小發(fā)夾RNA(FGF23i-shRNA)，以慢病毒載體pLKO.1為骨架，構(gòu)建重組載體。采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染沉默大鼠成骨細(xì)胞FGF23表達(dá)后，以10-9

6、mol/L rhPTH1-34作用2h，取細(xì)胞應(yīng)用Real-time PCR分析其FGF23、ALP和OCN mRNA水平。
　　結(jié)果:
　　1.PTH對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞分化具有一定刺激作用。PNPP法檢測結(jié)果顯示，10-12～10-8 mol/L rhPTH1-34間隙循環(huán)作用3d細(xì)胞總ALP活性增加14.8％～40％(P＜0.05～P＜0.001)，以10-9 mol/L濃度作用最明顯。MTT法測定結(jié)果顯示，10-10～

7、10-8 mol/L rhPTH1-34間隙循環(huán)作用3d細(xì)胞增殖率增加31.6％～50.5％(P＜0.05～P＜0.001)。細(xì)胞ALP比活性(OD405nm/OD570nm)在2.1～2.4之間波動(dòng)，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Real-time PCR結(jié)果顯示，10-9 mol/LrhPTH1-34作用2h時(shí)細(xì)胞ALP mRNA水平增加35％(P＜0.05)，8h和24 h時(shí)逐漸恢復(fù);OCN mRNA水平在2h時(shí)有增加趨勢（16％

8、，P＞0.05），8h時(shí)增加幅度加大至80％(P＜0.05)，24 h時(shí)恢復(fù)。
　　2.PTH上調(diào)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞FGF23表達(dá)。 Real-time PCR結(jié)果顯示，10-9mol/L rhPTH1-34作用2h時(shí)細(xì)胞FGF23 mRNA水平增加4倍(P＜0.001)，8h時(shí)增加67％(P＜0.05)，24 h時(shí)恢復(fù)。Westem blot分析結(jié)果顯示，10-9 mol/LrhPTH1-34作用3d細(xì)胞FGF23蛋白表達(dá)有增加趨

9、勢(41％)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　3.FGF23基因沉默后PTH促成骨細(xì)胞分化作用明顯增強(qiáng)。Real-time PCR結(jié)果顯示，10-9 mol/L rhPTH1-34作用2h，F(xiàn)GF23沉默(FGF23i-shRNA)細(xì)胞FGF23表達(dá)無上調(diào)，而其ALP和OCN表達(dá)明顯上調(diào)，其轉(zhuǎn)錄水平分別增加1.8倍(P＜0.05）和5.8倍（P＜0.01），明顯高于空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的43.5％(P＜0.05)和25.5％(