納米TiO2處理對(duì)家蠶先天免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的影響.pdf

1、家蠶（Bombyx mori）是鱗翅目的模式昆蟲(chóng)，也是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)。在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，家蠶和其它鱗翅目昆蟲(chóng)一樣形成了一套獨(dú)特的先天免疫系統(tǒng)，包括體液免疫和細(xì)胞免疫。其中體液免疫主要包括各種識(shí)別受體、胞內(nèi)信號(hào)因子、抗菌肽、蛋白酶以及酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)等。由于沒(méi)有后天免疫系統(tǒng)，家蠶主要通過(guò)先天免疫系統(tǒng)克服外界不良環(huán)境的影響以及抵抗外源微生物的侵染，如何提高家蠶對(duì)外界病原微生物的免疫力一直是蠶業(yè)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。在哺乳動(dòng)物中的研究結(jié)果表明，納

2、米粒子（Nanoparticles，NPs）能通過(guò)改變免疫細(xì)胞活性、非特異性提高或降低免疫反應(yīng)，進(jìn)而參與免疫調(diào)節(jié)以及激活相關(guān)補(bǔ)體系統(tǒng)這三種方式影響機(jī)體的先天免疫系統(tǒng)，但是納米粒子是否會(huì)影響家蠶的先天免疫系統(tǒng)還未有研究報(bào)道。
　　已有研究表明納米二氧化鈦（Titanium dioxide nanoparticles,TiO2NPs）具有抗菌功能，不僅抗菌效果持久，而且抗菌譜廣。銳鈦礦型 TiO2 NPs對(duì)大腸桿菌（Escherich

3、iacoli）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、芽桿菌（Bud bacillus）、曲霉（Aspergillus）以及沙門(mén)氏菌（Salmonella）等均具有很強(qiáng)的殺滅效果；低劑量（5 mg/L）的TiO2NPs，可以促進(jìn)家蠶的生長(zhǎng)，提高家蠶的飼料效率，提高蠶絲產(chǎn)量和質(zhì)量，還可以提高家蠶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥及家蠶核型多角體?。˙ombyx morinucle

4、opolyhedrovirus,BmNPV）的抵抗性，但尚未進(jìn)一步研究其對(duì)家蠶先天免疫系統(tǒng)的影響。因此，本研究采用5 mg/L的TiO2 NPs預(yù)處理家蠶，以家蠶黑胸?cái)⊙『虰mNPV為感染源，在分子水平和蛋白水平研究了TiO2 NPs對(duì)家蠶先天免疫系統(tǒng)的影響，獲得了以下研究結(jié)果：
　　1. TiO2 NPs處理后家蠶中腸數(shù)字基因表達(dá)譜分析
　　為了獲得TiO2 NPs預(yù)處理后的基因表達(dá)譜，本研究對(duì)五齡第3天家蠶中腸組織進(jìn)行

5、了數(shù)據(jù)基因表達(dá)譜（Digital gene expression profile,DGE）檢測(cè)。結(jié)果表明，TiO2 NPs預(yù)處理后，1105個(gè)基因發(fā)生了4.00倍以上的顯著差異，上調(diào)基因526個(gè)，下調(diào)基因579個(gè)，其中42個(gè)基因涉及15條通路的調(diào)節(jié)發(fā)生了顯著差異（P<0.05），其中涉及酪氨酸代謝（Tyrosine metabolism）的5個(gè)基因最高上調(diào)了12739.00倍，最低的上調(diào)了33.47倍，涉及黑色素合成（Melanogen

6、esis）的4個(gè)基因最高上調(diào)了1148.00倍，最低上調(diào)了33.47倍。根據(jù)基因的GO（Gene Ontology）注釋和KEGG（Kyoto Encyclopedia Of Genesand Genomes）通路分析，差異表達(dá)的基因主要參與了免疫應(yīng)答（Immune response），防御反應(yīng)（Defense response），能量代謝（Energy metabolism）和凋亡（Apoptosis）等代謝通路。免疫應(yīng)答中編碼MAP

7、激酶-ERK激酶的基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了65.80倍，防御反應(yīng)中編碼Moricin I，肽聚糖識(shí)別蛋白S6和β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白前體的基因轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)了97.68倍，2.68倍和2.16倍，凋亡調(diào)控中編碼負(fù)向調(diào)控凋亡蛋白GF12231的基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了48.84倍。結(jié)果表明，TiO2 NPs處理能促進(jìn)家蠶先天免疫系統(tǒng)中的酪氨酸代謝、黑色素形成以及抗菌肽Moricin I的表達(dá)，抑制家蠶細(xì)胞凋亡的發(fā)生，為研究TiO2 NPs對(duì)家蠶

8、先天免疫系統(tǒng)的影響以及將TiO2 NPs應(yīng)用于蠶病防治提供了有力的數(shù)據(jù)支撐。
　　2.體外條件下TiO2 NPs對(duì)家蠶黑胸?cái)⊙囊种菩Ч?br>　　為了探討在體外條件下TiO2NPs對(duì)家蠶黑胸?cái)⊙˙acillus bombyseptieus，Bb）的作用效果，本研究測(cè)定了家蠶黑胸?cái)⊙c濃度分別為0mg/L，5 mg/L，50 mg/L和100 mg/LTiO2NPs孵育后的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果表明TiO2NPs能抑制黑胸?cái)⊙?/p>

9、增殖，且具有劑量效應(yīng)，TiO2 NPs濃度越高，抑制作用越顯著。此外，TiO2 NPs與黑胸?cái)⊙饔貌煌瑫r(shí)間后的毒力檢測(cè)，結(jié)果表明TiO2 NPs對(duì)黑胸?cái)⊙囊种谱饔镁哂袝r(shí)間效應(yīng)，作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制效果越明顯；即TiO2 NPs能抑制黑胸?cái)⊙脑鲋常页尸F(xiàn)了劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。
　　3. TiO2 NPs處理對(duì)家蠶酚氧化酶活性影響和黑胸?cái)⊙〉囊种菩Ч?br>　　DGE數(shù)據(jù)分析可知TiO2 NPs能促進(jìn)家蠶的酪氨酸代謝和黑色

10、素形成，本研究進(jìn)一步對(duì)血淋巴中酚氧化酶活力進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，TiO2 NPs處理能將PPO酶原活力提高10.43％。qRT-PCR檢測(cè)了酚氧化酶級(jí)聯(lián)關(guān)鍵基因Mapk-Erk，PGRP-S2和BmPPO1，Toll免疫通路關(guān)鍵基因βGRP3，PGRP-S2和Rel，Imd免疫通路關(guān)鍵基因βGRP4，PGRP-S3和Imd以及抗菌肽Moricin I的基因轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)TiO2NPs預(yù)處理組與水處理組相比均呈現(xiàn)了不同程度上調(diào)，最高上調(diào)了

11、525.43倍，最低上調(diào)2.00倍。通過(guò)注射感染黑胸?cái)⊙?，發(fā)現(xiàn)TiO2 NPs預(yù)處理組家蠶的存活率提高了13.30%；qRT-PCR結(jié)果顯示，TiO2 NPs降低了家蠶黑胸?cái)⊙鸬姆友趸讣?jí)聯(lián)、Toll和Imd通路活化水平。RT-PCR檢測(cè)BmCaspase3基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)TiO2 NPs不僅抑制了家蠶自身細(xì)胞凋亡的發(fā)生，且能抑制家蠶黑胸?cái)⊙腥疽鸬募?xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明，TiO2 NPs通過(guò)促進(jìn)家蠶先天免疫系統(tǒng)中的酚氧化酶

12、級(jí)聯(lián)、Toll和Imd通路的活化水平和上調(diào)抗菌肽Moricin I的表達(dá)的途徑增強(qiáng)家蠶對(duì)黑胸?cái)⊙〉拿庖?，此外，它還能抑制家蠶細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　4. TiO2 NPs提高家蠶對(duì)BmNPV的抗性機(jī)制
　　本研究通過(guò)添食家蠶TiO2 NPs，研究其對(duì)BmNPV抗性的影響，分析了BmNPV在家蠶中腸內(nèi)的增殖特征以及家蠶抗BmNPV和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄差異。結(jié)果表明，低劑量的TiO2 NPs添食家蠶，可以提高家蠶對(duì)BmNPV

13、的抗性，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組144 h的死亡率分別是0.56%和8.33%，TiO2NPs預(yù)處理顯著降低了死亡率。BmNPV在中腸內(nèi)的增殖特征分析表明，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在感染BmNPV后72 h開(kāi)始明顯增殖，對(duì)照組在120 h達(dá)到最高峰，實(shí)驗(yàn)組在144 h才達(dá)到最高峰，高峰值相差12.63倍，表明家蠶添食TiO2 NPs可以抑制BmNPV在中腸內(nèi)增殖，中腸中受BmNPV誘導(dǎo)的家蠶抗BmNPV基因Bmlipase-1的轉(zhuǎn)錄特征也和BmNPV的增殖

14、規(guī)律一致。免疫信號(hào)通路分析表明，添食 TiO2 NPs抑制家蠶體內(nèi) BmNPV的增殖進(jìn)而可以降低JAK/STAT和PI3K-Akt的激活水平，但可以促進(jìn)基因Bmakt的表達(dá)，提高家蠶自身的免疫力。這些結(jié)果表明，TiO2 NPs提高家蠶對(duì) BmNPV的抗性的機(jī)制是通過(guò)抑制BmNPV在家蠶體內(nèi)的增殖以及提高自身免疫來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　5. TiO2 NPs對(duì)家蠶BmN細(xì)胞的影響
　　本研究以家蠶卵巢細(xì)胞（BmN）為研究對(duì)象，檢測(cè)了濃

15、度為1.25 mg/L，2.5 mg/L，5mg/L，10mg/L，50 mg/L和100 mg/L的TiO2NPs處理對(duì)BmN細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs能促進(jìn)BmN細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)了劑量效應(yīng)，在100 mg/L濃度范圍內(nèi)，TiO2NPs濃度越高，促進(jìn)作用越明顯。此外，本研究還檢測(cè)了5 mg/L TiO2 NPs對(duì)BmN細(xì)胞活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TiO2 NP

16、s能顯著降低BmN細(xì)胞的ROS水平。
　　本課題研究了TiO2 NPs對(duì)家蠶先天免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的影響，獲取了TiO2 NPs處理后家蠶五齡第3天中腸組織的基因表達(dá)譜，闡明了TiO2 NPs通過(guò)促進(jìn)家蠶的酚氧化酶級(jí)聯(lián)、Toll和Imd通路的活化水平以及上調(diào)抗菌肽Moricin I表達(dá)的途徑增強(qiáng)家蠶對(duì)黑胸?cái)⊙〉目剐?，通過(guò)抑制BmNPV在家蠶體內(nèi)的增殖以及提高自身免疫的途徑增強(qiáng)家蠶對(duì)BmNPV的抗性。本研究闡明了TiO2 NPs對(duì)家蠶先