自噬基因Beclin 1與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性研究.pdf

1、骨肉瘤是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤,轉(zhuǎn)移發(fā)生早,預(yù)后差。目前臨床上對(duì)骨肉瘤的治療多采用手術(shù)、化療等綜合治療,雖然五年生存率較前有明顯提高,但療效仍不滿意。大劑量化療帶來的嚴(yán)重副反應(yīng)以及多藥耐藥等問題使得骨肉瘤的治療難以完全治愈?；蛑委熆赡艹蔀槟切┮褑适中g(shù)時(shí)機(jī)患者的新的治療手段。研究表明,腫瘤細(xì)胞惡性增殖,死亡的減少與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的密切相關(guān)。并且使細(xì)胞耐受放療、化療的刺激。因而,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡成為了一種新的殺傷腫瘤細(xì)胞的治療策略

2、。 自噬性細(xì)胞死亡是一種不同于凋亡、不依賴caspase的程序性細(xì)胞死亡。有研究表明自噬的抑制與腫瘤的發(fā)生有關(guān),沉默自噬基因Beclinl可導(dǎo)致多種惡性腫瘤的發(fā)生,是一個(gè)候選的腫瘤抑制基因。因此,我們認(rèn)為,骨肉瘤的Beclinl表達(dá)狀況的研究是極具研究?jī)r(jià)值的課題。Beclinl基因可能成為骨肉瘤基因治療更具針對(duì)性的目的基因,研究自噬基因Beclinl在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)狀況以揭示其在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的意義,對(duì)于揭示骨肉瘤的發(fā)病機(jī)

3、理,并尋找針對(duì)這一頑疾的新的治療策略,具有十分重大的意義。為此我們進(jìn)行了以下三部分實(shí)驗(yàn)研究。 第一部分 Beclinl基因在人成骨肉瘤細(xì)胞株MG63和人成骨細(xì)胞株hF0B1.19中mRNA及蛋白表達(dá)的差異性 目的:明確人成骨肉瘤細(xì)胞MG63以及人成骨細(xì)胞hF0B1.19中自噬基因Beclinl的表達(dá)差異情況,探討其與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。 方法:采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及免疫印記法(Wester

4、n blot),對(duì)人成骨肉瘤細(xì)胞MG63及成骨細(xì)胞hF0B1.19中Beclinl mRNA及蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果:人成骨肉瘤細(xì)胞MG63中Beclinl mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低,其表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組人成骨細(xì)胞hF081.19。 結(jié)論:自噬基因Beclinl在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)異常與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。 第二部分 Beclinl基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及鑒定 目的:構(gòu)建攜帶自噬

5、基因BeclinlcDNA的真核表達(dá)質(zhì)粒,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染并在人成骨肉瘤細(xì)胞MG63中表達(dá),為骨肉瘤的基因治療奠定基礎(chǔ)。 方法:應(yīng)用基因重組技術(shù)和限制性內(nèi)切酶,酶切構(gòu)建并鑒定pEGFP/Beclinl真核表達(dá)質(zhì)粒,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的骨肉瘤細(xì)胞株MG63細(xì)胞,熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及免疫印記法(Western blot)來檢驗(yàn)?zāi)康幕蚣捌涞鞍妆磉_(dá)情況。 結(jié)果:重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEDFP/Becli

6、nl中插入序列由大連寶生物公司測(cè)序核實(shí),證明重組質(zhì)粒連接正確,經(jīng)定量RT-PCR檢測(cè)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人成骨肉瘤細(xì)胞株MG63后,Beclinl mRNA在人成骨肉瘤細(xì)胞MG63同空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染的人成骨肉瘤細(xì)胞MG63的相對(duì)拷貝量明顯增加,Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后人成骨肉瘤細(xì)胞MG63中Beclinl蛋白明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組。 結(jié)論:成功地構(gòu)建了pEGFP/Beclinl真核表達(dá)質(zhì)粒,并能在人成骨肉瘤細(xì)胞

7、中表達(dá)Beclinl mRNA,為骨肉瘤的基因治療提供了必要的條件。 第三部分 外源性人Beclin1基因轉(zhuǎn)染對(duì)人成骨肉瘤細(xì)胞MG6體外生長(zhǎng)的抑制作用 目的：研究外源性人Beclinl基因在人成骨肉瘤細(xì)胞MG63中過表達(dá)對(duì)其體外生長(zhǎng)的抑制作用和對(duì)甲氨碟呤化療敏感性以及細(xì)胞自噬的影響。 方法：應(yīng)用重組質(zhì)粒pEGFP/Beclinl,以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人成骨肉瘤細(xì)胞株MG63,以pEGFP及空白轉(zhuǎn)染組為對(duì)照

8、,應(yīng)用MTT法分析外源性Beclinl過表達(dá)對(duì)人成骨肉痛細(xì)胞株G63增殖的影響,并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率的變化和對(duì)MTX的化療療效的影響。應(yīng)用MDC染色觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞自噬情況 結(jié)果：pEGFP/Beclinl轉(zhuǎn)染人成骨肉瘤細(xì)胞MG63后細(xì)胞增殖有明顯減慢,較PEGFP轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組兩者之間差異有顯著性(P<0.05)。pEGFP/Beclinl轉(zhuǎn)染72小時(shí)后人成骨肉瘤細(xì)胞MG63的凋亡率高于對(duì)照組,差異有顯著性(P<0.05)。