新型超分子層層自組裝微囊肝細(xì)胞培養(yǎng)體系構(gòu)建的研究.pdf

1、急性肝功能衰竭(Acute Liver Failure，ALF)，是一種嚴(yán)重的臨床綜合征，其致死率高達(dá)60％～90%。肝移植已經(jīng)被認(rèn)為是爆發(fā)性肝炎、終末期肝病的有效治療手段，然而，供肝短缺、高發(fā)病率、高死亡率、昂貴治療費(fèi)用高昂以及術(shù)后終生應(yīng)用免疫抑制劑等一系列問題困擾著肝移植廣泛開展。特別是供肝的短缺極大的限制了可能行肝移植的數(shù)量，許多病人在等待移植中死去，多年來，人們一直在致力于發(fā)展肝臟支持系統(tǒng)維持肝功能，肝臟支持系統(tǒng)作為一個(gè)過渡措施

2、架起了通往移植的橋梁，但是肝臟支持系統(tǒng)仍然沒有發(fā)展成熟，許多方面依然沒有達(dá)到臨床治療的標(biāo)準(zhǔn)，本研究的目的就是設(shè)計(jì)制備一種新型的超分子層層自組裝微囊，并且在體外用此微囊去微囊化包裹肝細(xì)胞，評(píng)估肝細(xì)胞在其中的生長，增殖情況和細(xì)胞的生物學(xué)活性，作為邁向生物人工肝的基礎(chǔ)研究。
　　 在這項(xiàng)研究中，微囊由低分子肝素鈉(low-molecular-weight heparin sodium，LMWH)、海藻酸鈉(algin，ALG)和殼聚糖

3、(chitosan,CS)利用超分子層層自組裝技術(shù)通過高壓脈沖微囊成形儀制備而成，微囊的大小通過仔細(xì)的調(diào)整高壓脈沖微囊成形儀的電壓、頻率和脈寬來控制和優(yōu)化，優(yōu)化后的微囊進(jìn)一步去研究其物理性質(zhì)，諸如，微囊壁的分子截留孔徑、微囊的表面形態(tài)、微囊壁的厚度、微囊表面的電荷、機(jī)械強(qiáng)度、生物相容性和免疫隔離作用等。隨后，通過改良門靜脈灌注膠原酶消化法分離小鼠原代肝細(xì)胞，經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)后在其活力良好時(shí)通過新型微囊進(jìn)行微囊化包裹，同時(shí)利用ACA微囊成型技術(shù)

4、微囊化包裹肝細(xì)胞，把這兩種微囊化肝細(xì)胞與原代單層平面培養(yǎng)肝細(xì)胞進(jìn)行分組進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，組1為ALG-CS-ALG(ACA)微囊化肝細(xì)胞組；組2為ALG+LMWH-CS-ALG+LMWH(ALCAL)微囊化肝細(xì)胞組；組3為單層肝細(xì)胞平面培養(yǎng)組(Tissue culture polystyrene，TCPS);對(duì)蘭組細(xì)胞進(jìn)行17天的培養(yǎng)，在培養(yǎng)后1天、2天、3天、5天，取樣觀察細(xì)胞活率、增殖狀態(tài)，部分取樣進(jìn)行HE染色制作切片觀察各個(gè)時(shí)間細(xì)胞

5、的形態(tài)變化和凋亡及壞死情況，并在培養(yǎng)后每隔一天總9個(gè)時(shí)間點(diǎn)取培養(yǎng)液樣本分析其中糖、白蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶的濃度變化以評(píng)價(jià)微囊化細(xì)胞的功能變化。
　　 本項(xiàng)研究的結(jié)果顯示新型層層自組裝微囊ALCAL大小理想，直徑600-800um，平均直徑782.8um，ALCAL微囊外表光滑，囊壁具有合適的分子截留孔徑、囊壁的厚度大約在2-3nm左右，表面分布陰性電荷，ALCAL微囊具有較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度，較好的長期穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性，擁有良好的生物相

6、容性，ALCAL微囊的溶漲率是10.7%，溶縮率是33.1%。對(duì)其進(jìn)行的通透性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其具有明顯的免疫隔離作用，其囊壁能讓FITC-BSA通過，但能阻擋FITC-IgG等大分子物質(zhì)進(jìn)入囊內(nèi)，ALCAL微囊化包裹的肝細(xì)胞培養(yǎng)后保持了其細(xì)胞活力，與原代單層平面細(xì)胞培養(yǎng)相比顯示了更好的代謝活性，組1和組2在細(xì)胞活率和代謝功能上沒有明顯的差異，微囊化細(xì)胞具有強(qiáng)烈的分泌蛋白功能，保持了細(xì)胞活力。
　　 本研究制備的新型微囊ALCAL具有良