mTOR介導(dǎo)EAAT3促進(jìn)豬腸上皮細(xì)胞增殖和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制.pdf

1、EAAT3（excitatory amino acid transporter3）是腸道上皮細(xì)胞（IEC）主要的酸性氨基酸（包括谷氨酸和天冬氨酸）轉(zhuǎn)運(yùn)載體。為了研究EAAT3對(duì)豬腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2（porcine jejunal epithelial cell line）細(xì)胞增殖和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，本試驗(yàn)采用PCR擴(kuò)增技術(shù)，克隆得到長(zhǎng)白豬EAAT3 cDNA序列并構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體，獲得 EAAT3過(guò)表達(dá)的IPEC-J2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

2、在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)并合成EAAT3 RNA干擾序列，對(duì)IPEC-J2細(xì)胞中的EAAT3進(jìn)行RNA干擾。利用全自動(dòng)氨基酸分析儀檢測(cè)了EAAT3對(duì)游離氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響；應(yīng)用MTT和細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)了EAAT3對(duì)IPEC-J2細(xì)胞增殖的影響；采用real-time PCR和Westernblot技術(shù)，分析EAAT3對(duì)mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白和谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體xCT表達(dá)水平的影響。為開(kāi)展谷氨酸感應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)的研究奠定基礎(chǔ)。
　　試驗(yàn)結(jié)果如下：<

3、br>　?。?）豬EAAT3 cDNA克隆及EAAT3過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的獲取。同源性克隆得到長(zhǎng)度為1575 bp的豬EAAT3cDNA片段。構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體EAAT3-pcDNA3.1+，篩選獲得 EAAT3過(guò)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。細(xì)胞免疫熒光技術(shù)、real-time PCR和Western blot鑒定EAAT3成功過(guò)表達(dá)。
　　（2）EAAT3在IPEC-J2細(xì)胞中有效RNA干擾的獲取。根據(jù)克隆得到的EAAT3完整CDS序列設(shè)計(jì)3對(duì)

4、干擾序列，real-time PCR和Western blot鑒定EAAT3RNA干擾情況，獲取最佳干擾序列siRNA-003的最佳干擾時(shí)間點(diǎn)為48 h。
　?。?）EAAT3對(duì)IPEC-J2細(xì)胞氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞增殖的影響。EAAT3在調(diào)控酸性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的同時(shí)過(guò)表達(dá)后可以顯著促進(jìn)胱氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)并且RNA干擾后可以顯著抑制胱氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。MTT和細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示，EAAT3過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞增殖能力顯著高于對(duì)照組。
　?。?）EAA

5、T3對(duì)mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的影響。EAAT3過(guò)表達(dá)后可以顯著上調(diào) mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平；EAAT3 RNA干擾后可以顯著下調(diào)mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平。
　?。?）EAAT3對(duì)ATF4/xCT途徑的影響。EAAT3過(guò)表達(dá)后可以顯著上調(diào)xCT及其轉(zhuǎn)錄因子ATF4的表達(dá)水平；EAAT3 RNA干擾后可以顯著下調(diào)xCT及其轉(zhuǎn)錄因子ATF4的表達(dá)水平。
　　結(jié)論：
　?。?）豬EAAT3可能通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)谷