DAL-1基因的蛋白表達及其點突變(1810C-T-575Cys-Tyr)與非小細胞肺癌轉移的關系.pdf

1、肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其中80％～85％為非小細胞肺癌 (None Small Cell Lung Caneer，NSCLC)。侵襲和轉移是導致NSCLC治療失敗及絕大多數(shù)患者死亡的主要原因，因而尋找肺癌侵襲和轉移相關基因及其分子指標成為當前迫切需要解決的問題。
　　 DAL-1（Differentially expressed in adenocarcinoma of the lung）是4.1家族成員之一，在NSCLC

2、、乳腺癌和腦膜瘤中表達下調或缺失[1-4]。轉染DAL-1至NSCLC和乳腺癌細胞株中使其重新表達，可抑制這些細胞增殖[1,5]，表明DAL-1是一種腫瘤抑制基因。
　　 免疫細胞化學方法顯示DAL-1蛋白定位于細胞膜的胞質側，主要集中在細胞間的連接處，呈“honeycomb”狀分布[1]。Charboneau AL等[6]研究發(fā)現(xiàn)DAL-1表達可以增強乳腺癌細胞之間的連接。我們前期體外實驗發(fā)現(xiàn)，沉默DAL-1蛋白表達可使NSC

3、LC細胞侵襲和遷移能力增強[7]。由此推測，該基因表達缺失可能削弱細胞間的連接和黏附從而導致腫瘤細胞易于發(fā)生脫落和轉移。本次實驗我們擬通過對人肺癌組織中DAL-1蛋白表達進行檢測，并與臨床病理因素進行對比分析，進一步驗證DAL-1表達與NSCLC轉移的關系。
　　 基因失活的機制包括基因缺失、突變等遺傳學機制及DNA甲基化、染色質構象變化等表觀遺傳學機制。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，DAL-1基因啟動子甲基化是導致NSCLC細胞系和細胞株

4、中DAL-1表達缺失的主要原因；但在部分DAL-1表達缺失的腫瘤細胞中，DAL-1基因啟動子并沒有出現(xiàn)甲基化[7]，因此推測可能存在其他導致DAL-1表達缺失的原因。點突變是基因表達缺失的常見原因之一，目前研究認為DAL-1存在多個點突變位點，包括：1810 C>T/575Cys>Tyr，2166 C>T/704Thr>Thr，2146 G>T/716 Ala>Ser，2166 C>T/722Thr>Thr等，其中1810 C>T/57

5、5Cys>Tyr突變發(fā)生頻率較高，且為錯義突變[8-10]。因此本研究通過對人體組織DAL-1基因1810C>T/575Cys>Tyr點突變的檢測，分析其與DAL-1蛋白表達的關系，進一步探討DAL-1蛋白表達缺失的原因。
　　 方法：
　　 一、免疫組化方法檢測石蠟包埋的NSCLC組織167例（其中149例備有配對癌旁組織）的DAL-1蛋白表達，分析其與NSCLC臨床病理因素的關系。數(shù)據采用χ2檢驗進行統(tǒng)計學分析。

6、r>　　 二、提取204例NSCLC患者配對組織標本（石蠟包埋NSCLC組織和同一患者正常淋巴結組織）及112例NSCLC患者新鮮血液標本（共316例）基因組DNA，PCR-RFLP方法檢測DAL-1基因1810 C>T基因型，分析1810 C>T點突變與DAL-1蛋白表達及NSCLC轉移的關系。數(shù)據采用χ2檢驗進行統(tǒng)計學分析。
　　 結果：
　　 一、167例NSCLC組織中，DAL-1蛋白陽性表達97例（58.1％

7、），陰性70例（41.9％）。其中149例NSCLC配對標本中，癌旁組織DAL-1陽性表達135例（90.6％），陰性14例（9.4％）；癌組織DAL-1陽性表達87例（58.4％），陰性62例（41.6％）；NSCLC癌組織DAL-1陽性表達率顯著低于癌旁組織（p＜0.05）。
　　 二、167例NSCLC組織中，DAL-1蛋白表達陽性率在腫瘤最大直徑≤3cm組(47/66)顯著高于腫瘤最大直徑＞3cm組(50/101)（p＜

8、0.01），未發(fā)生轉移組(64/78)顯著高于轉移組(33/89)（p＜0.000），Ⅰ期、Ⅱ期(67/91)顯著高于Ⅲ期、Ⅳ期(30/76)（p＜0.000）。其中148例腺癌和鱗癌DAL-1蛋白表達陽性率高、中分化組(63/93)顯著高于低分化組(27/55)（p＜0.005）。
　　 三、316例NSCLC患者DAL-1 1810 C>T基因型分布：野生型基因型TT293例（92.7％），突變型基因型23例，突變率為4.1

9、％。其中CT20例（6.3％），CC3例（0.9％）。204例NSCLC患者正常淋巴結組織與其NSCLC組織配對資料共408個標本基因型檢測結果表明：各例NSCLC腫瘤組織和相應正常淋巴結組織基因型完全一致。
　　 四、167例NSCLC組織中，發(fā)生DAL-1 1810 C>T點突變者13例。13例發(fā)生點突變患者的癌組織中DAL-1蛋白陽性表達5例，陰性8例；相應的癌旁組織DAL-1蛋白陽性表達7例，陰性5例，1例無配對癌旁組織

10、。5例點突變患者癌組織DAL-1蛋白雖陽性表達，但均發(fā)生轉移。提示DAL-1 1810 C>T點突變可能削弱DAL-1對腫瘤轉移的抑制作用。
　　 五、在316例標本中，突變的23例中17例發(fā)生轉移，6例未發(fā)生轉移；在293例野生型的標本中，149例發(fā)生轉移，144例未發(fā)生轉移，NSCLC轉移在DAL-1突變型與野生型組間差異有統(tǒng)計學意義（p<0.025）。提示DAL-1 1810 C>T點突變可能導致NSCLC更容易發(fā)生轉移。

11、
　　 六、分析經免疫組化方法檢測蛋白表達的167例NSCLC組織DAL-1 1810 C>T點突變與腫瘤臨床病理因素關系發(fā)現(xiàn)，DAL-1 1810 C>T點突變基因型分布頻率在腫瘤最大直徑≤3cm組（6/66）與腫瘤最大直徑＞3cm組（7/101），Ⅰ期、Ⅱ期組（8/91）與Ⅲ期、Ⅳ期組（5/76），組間無顯著性差異（P＞0.05）。DAL-1 1810 C>T點突變基因型分布頻率在轉移組（11/89）與無轉移組（2/78）間

12、有顯著性差異（P＜0.025）.
　　 結論：
　　 一、人NSCLC腫瘤組織存在DAL-1蛋白表達降低、缺失現(xiàn)象。
　　 二、NSCLC轉移組的DAL-1蛋白表達陽性率顯著低于未轉移組，提示DAL-1蛋白表達降低、缺失可能與NSCLC轉移有關。
　　 三、人NSCLC組織中DAL-1 1810 C>T突變率為4.1％。DAL-1 1810 C>T點突變不是導致DAL-1蛋白表達降低、缺失的主要原因。DA