玉米根系ZmOSMAPK1基因分離、功能鑒定及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用.pdf

1、MAPK級(jí)聯(lián)途徑是真核生物中廣泛存在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。MAPK級(jí)聯(lián)途徑由三類蛋白激酶組成：MAPKKK-MAPKK-MAPK，通過依次磷酸化傳遞環(huán)境信號(hào)。植物中的MAPK途徑與其他信號(hào)途徑交織在一起，形成了一個(gè)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，參與生長(zhǎng)發(fā)育和各種生物、非生物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 近年來(lái)，在植物中分離到大量MAPKs，并在其作用機(jī)理研究方面取得了長(zhǎng)足進(jìn)展。然而，植物中MAPK的研究主要集中在雙子葉模式植物(如擬南芥、煙草和紫花苜蓿等)中，關(guān)于玉米

2、MAPK方面的研究很少。因此，本文以玉米Zheng958為試材，對(duì)玉米MAPK進(jìn)行了基因克隆、序列比對(duì)、表達(dá)特性及其蛋白活性分析，并對(duì)其所參與的信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行了深入研究。主要結(jié)果如下： 1.玉米中MAPK類蛋白激酶活性分析 利用MAPK專一底物MBP，通過溶液激酶試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干旱、高鹽和低溫均能誘導(dǎo)玉米中MAPK活性的迅速增加。表明在三種脅迫條件下，玉米MAPK級(jí)聯(lián)途徑起著重要作用。三種脅迫條件下激酶活性在2小時(shí)內(nèi)達(dá)到較

3、高水平，隨后出現(xiàn)明顯下降，說(shuō)明在玉米體內(nèi)存在著有效的MAPK調(diào)控機(jī)制。三種脅迫處理所誘導(dǎo)的MAPK活性的最高值以及最高值出現(xiàn)的時(shí)間表現(xiàn)出較大差異，暗示著在不同脅迫條件下有不同的MAPK途徑被激活。外源信號(hào)分子H2O2、SA和ABA同樣能快速誘導(dǎo)MAPK激酶活性的增加。以上結(jié)果表明，MAPK級(jí)聯(lián)途徑在玉米的多種信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)外界刺激引起的MAPK的活化可被MEK激酶抑制劑PD98059所抑制，被蛋白質(zhì)合成抑制劑CH

4、X所削弱，被磷酸酶抑制劑PAO所增強(qiáng)。 2.ZmOSMAPK1基因的分離及其特征 利用同源序列設(shè)計(jì)兼并引物，通過RT-PCR和RACE-PCR的方法從PEG脅迫的玉米根系中分離到一種MAPK基因，命名為ZmOSMAPK1(玉米滲透脅迫和鹽脅迫誘導(dǎo)促分裂原活化蛋白激酶1)。GenBbank注冊(cè)號(hào)為DQ422149。其全長(zhǎng)為1627bp，編碼一個(gè)373氨基酸多肽段。序列分析表明，ZmOSMAPK1大部分氨基酸為疏水氨基酸，并

5、含有兩個(gè)推測(cè)的跨膜區(qū)，其中217-235aa處跨膜區(qū)具有較強(qiáng)的外向跨膜能力。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)ZmOSMAPK1具有11個(gè)保守亞區(qū)和TEY特征磷酸化位點(diǎn)，C端具有一個(gè)底物結(jié)合錨定位點(diǎn)(CDdomain)，與擬南芥AtMPK4和煙草NtMPK4有較高同源性，同屬于TEY類B組MAPK亞類。ZmOSMAPK1與已知功能的玉米MAPK蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，功能可能存在較大差異。 3.ZmOSMAPK1表達(dá)特性分析 Northern表達(dá)分

6、析表明，干旱誘導(dǎo)的ZmOSMAPK1在玉米根、莖和葉中均有表達(dá)，葉中誘導(dǎo)的表達(dá)水平最高，其次是根，莖中最少。ZmOSMAPK1能夠被干旱，高鹽誘導(dǎo)表達(dá)，然而4℃低溫并不能誘導(dǎo)ZmOSMAPK1表達(dá)產(chǎn)物的積累。信號(hào)分子SA，H2O2，ABA同樣能誘導(dǎo)ZmOSMAPK1表達(dá)增加。ZmOSMAPK1對(duì)不同刺激的響應(yīng)模式有所不同，干旱誘導(dǎo)ZmOSMAPK1的表達(dá)持續(xù)時(shí)間要長(zhǎng)于高鹽脅迫。信號(hào)分子SA、H2O2均能誘導(dǎo)該基因的快速表達(dá)，而ABA處理

7、下ZmOSMAPK1的表達(dá)遲于其他處理，表明ABA能夠以一種特殊的方式調(diào)控ZmOSMAPK1在玉米中表達(dá)。 4.ZmOSMAPK1蛋白激酶活性分析 外界刺激不僅能誘導(dǎo)ZmOSMAPK1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累，而且能夠誘導(dǎo)ZmOSMAPK1激酶活性的增加。干旱、高鹽誘導(dǎo)的ZmOSMAPK1蛋白激酶活性的變化趨勢(shì)類似于ZmOSMAPK1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物積累，短時(shí)間內(nèi)(1h)迅速上升，隨即(3h)下降。表明在干旱和高鹽條件下，ZmOSMAPK

8、1活化不僅需要蛋白質(zhì)的磷酸化修飾過程，而且存在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。ZmOSMAPK1蛋白產(chǎn)物的活性變化要早于其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的變化，暗示著ZmOSMAPK1的活性調(diào)控在蛋白質(zhì)水平上更為靈敏。雖然低溫不能誘導(dǎo)ZmOSMAPK1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累，但能迅速誘導(dǎo)ZmOSMAPK1的激酶活性，且持續(xù)時(shí)間較短，1h后明顯下降，這可能與ZmOSMAPK1轉(zhuǎn)錄不能被低溫所誘導(dǎo)有關(guān)。信號(hào)分子SA、H2O2處理發(fā)現(xiàn)，ZmOSMAPK1轉(zhuǎn)錄和激酶活性變化與PEG處理表現(xiàn)

9、出類似的結(jié)果。ABA不僅能持續(xù)誘導(dǎo)ZmOSMAPK1的轉(zhuǎn)錄活性，而且能誘導(dǎo)ZmOSMAPK1持續(xù)的蛋白激酶活性。這種同一種信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)不同外界刺激具有不同響應(yīng)的機(jī)理還不清楚，尚需進(jìn)一步的研究。利用H2O2清除劑DMTU研究發(fā)現(xiàn)，ZmOSMAPK1的活化需要玉米體內(nèi)H2O2的積累，H2O2介導(dǎo)了環(huán)境信號(hào)在ZmOSMAPK1級(jí)聯(lián)途徑中的信號(hào)傳導(dǎo)過程。 5.ZmOSMAPK1超表達(dá)擬南芥植株表現(xiàn)出對(duì)干旱和NaCl脅迫抗性的提高

10、 轉(zhuǎn)基因擬南芥抗逆性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥在干旱和鹽脅迫下能正常開花結(jié)實(shí)，而野生型植株則不能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥中H2O2和MDA含量明顯低于野生型植株，具有更高的活性氧清除能力。這可能是轉(zhuǎn)基因植株抗性提高的主要原因之一。此外，轉(zhuǎn)基因擬南芥在脅迫條件下能保持較高水勢(shì)和較低滲透勢(shì)，具有較強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力。 6.ZmOSMAPK1參與了擬南芥SA的負(fù)調(diào)控過程 轉(zhuǎn)基因擬南芥中SA的積累和SA響應(yīng)基因(PR

11、2和PR5)的表達(dá)受到極大抑制。SA處理擬南芥幼苗，野生型植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的SA響應(yīng)表型，植株矮小，生長(zhǎng)變緩。這些結(jié)果證實(shí)了ZmOSMAPK1對(duì)SA的負(fù)調(diào)控作用。ZmOSMAPK1超表達(dá)擬南芥植株中JA響應(yīng)基因(PDF1.2和THI2.1)的表達(dá)相對(duì)增強(qiáng)，而研究發(fā)現(xiàn)其同源物AtMPK4誘導(dǎo)JA響應(yīng)基因表達(dá)的增強(qiáng)不依賴于SA水平，表明ZmOSMAPK1參與了JA信號(hào)傳導(dǎo)過程。以上結(jié)果表明，玉米ZmOSMAPK1是平衡和調(diào)節(jié)由植物抗病信號(hào)傳導(dǎo)