脆性X綜合征小鼠前額葉可塑性異常的機(jī)制研究.pdf

1、【目的】
　　探索FMR1KO小鼠突觸可塑性調(diào)節(jié)異常的機(jī)制以及如何恢復(fù)ACC區(qū)的可塑性，以期對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)脆性X綜合癥的病理機(jī)制，發(fā)掘潛在的藥物治療新靶點(diǎn)。
　　【方法】
　　1、全細(xì)胞膜片鉗記錄
　　小鼠采用1-2％異氟醚麻醉，取腦。振動(dòng)切片機(jī)橫向切取300μmACC腦片，室溫下置于混合氣飽和的人工腦脊液(ACSF)中，恢復(fù)1小時(shí)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在具有紅外線DIC系統(tǒng)的顯微鏡下觀察ACC第II/III層錐體神經(jīng)元。A

2、CSF灌流液中加入100Mpicrotoxin，刺激電極放置于ACC第V層，記錄電極放置于ACC第II/III層，在錐體神經(jīng)元中選取狀態(tài)良好的椎體神經(jīng)元進(jìn)行封接。記錄興奮性突觸后電流（EPSC）和LTP。LTP誘導(dǎo)方法：80次刺激，頻率2Hz，同時(shí)神經(jīng)元鉗制于+30mV，然后恢復(fù)到基線記錄模式，鉗制電壓恢復(fù)在-70mV。記錄mEPSC時(shí)，灌流液中加入TTX，轉(zhuǎn)換為Gapfree記錄模式。
　　2、小鼠前額葉皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)

3、r>　　取孕18天胎鼠，在無菌條件下斷頭取腦置于盛有PBS液的平皿中剝?nèi)ツX膜，取大腦皮層并剪碎，消化后反復(fù)吹打制備細(xì)胞懸液。接種于涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)第三天加入阿糖胞苷，以抑制非神經(jīng)元細(xì)胞的繼續(xù)增長(zhǎng)。SKF81297（5μM），DL-AP3（10μM)），和forskolin（5μM）在收集細(xì)胞前24小時(shí)分組加入培養(yǎng)基，收集細(xì)胞待用。
　　3、Westernblot檢測(cè)
　　采用常規(guī)腦組織樣本制備

4、方法制備ACC區(qū)組織樣品。培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞膜蛋白的提取，采用細(xì)胞膜蛋白生物素試劑盒提取的方法，提取過程同過往文獻(xiàn)報(bào)道[1]。Westernblot檢測(cè)方法：將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上后，分別用mGluR5，GluR1，NR2A，NR2B，p-NR2B的一抗封閉各自分子量相應(yīng)的條帶，孵育后，漂洗，加入二抗漂洗發(fā)光。曝光完成后，經(jīng)顯影和定影，自來水沖洗，最后在室溫下晾干。用β-actin或cadherin作為標(biāo)準(zhǔn)定量分子，確定各個(gè)蛋白相對(duì)量的多少。<

5、br>　　4、行為學(xué)實(shí)驗(yàn)
　　開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)裝置由曠場(chǎng)反應(yīng)箱和數(shù)據(jù)自動(dòng)采集和處理系統(tǒng)兩部分組成，實(shí)驗(yàn)小鼠置于曠場(chǎng)的中央，記錄并分析它的運(yùn)動(dòng)情況。高架十字迷宮各有兩個(gè)對(duì)稱的開放臂和封閉臂，十字中間為正方形平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)小鼠逐個(gè)放于中央平臺(tái)后，記錄每個(gè)小鼠5min內(nèi)進(jìn)入開放臂或封閉臂的次數(shù)與時(shí)間，并計(jì)算進(jìn)入兩臂的總次數(shù)。Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)數(shù)天,每天將大鼠面向池壁分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入水中若干次,記錄其尋找到隱藏在水面下平臺(tái)的時(shí)間。

6、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)小鼠在實(shí)驗(yàn)前分別腹腔注射生理鹽水，DL-AP3和/或SKF81297，45分鐘后開始實(shí)驗(yàn)。
　　【結(jié)果】
　　1、SKF81297和DL-AP3對(duì)FMR1基因敲除小鼠LTP的增強(qiáng)
　　我們用全細(xì)胞膜片鉗的方法對(duì)成年腦薄片的前扣帶回區(qū)II-III層錐體細(xì)胞的電生理活動(dòng)進(jìn)行記錄，采用突觸前電刺激誘導(dǎo)突觸后去極化的方法使神經(jīng)元產(chǎn)生LTP并記錄。我們發(fā)現(xiàn)在FMR1WT小鼠，該腦區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生了明顯的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)現(xiàn)象。但在F

7、MR1KO小鼠，這種增強(qiáng)效應(yīng)不明顯。我們發(fā)現(xiàn)，正常和敲除小鼠的LTP效應(yīng)與各自的空白對(duì)照組相比沒有顯著性差異。接下來，我們檢測(cè)了D1受體激動(dòng)劑應(yīng)用組的LTP誘導(dǎo)情況，發(fā)現(xiàn)在D1受體激動(dòng)劑SKF812975μM孵育十分鐘后，正常小鼠腦薄片誘導(dǎo)后的LTP效應(yīng)明顯增強(qiáng),說明激活D1受體能增強(qiáng)正常小鼠的LTP效應(yīng)。而在FMR1KO小鼠，應(yīng)用SKF81297沒有增強(qiáng)其誘導(dǎo)后的LTP效應(yīng)，說明D1受體激動(dòng)劑的LTP增強(qiáng)作用在FMR1基因敲除小鼠AC

8、C區(qū)是受損的。
　　我們?cè)跈z測(cè)同時(shí)使用D1受體激動(dòng)劑和mGluR1受體拮抗劑對(duì)LTP誘導(dǎo)的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)SKF81297和DL-AP3共同孵育腦片十分鐘，能顯著增強(qiáng)正常小鼠的LTP效應(yīng)，這種增強(qiáng)效應(yīng)與單獨(dú)應(yīng)用D1受體激動(dòng)劑SKF81297的正常小鼠相比沒有顯著性差異。在FMR1基因敲除小鼠，同時(shí)使用D1受體激動(dòng)劑和mGluR1受體拮抗劑，ACC區(qū)LTP效應(yīng)與單獨(dú)使用D1受體激動(dòng)劑有顯著性增強(qiáng)。
　　為了檢測(cè)合用SKF81297

9、和DL-AP3對(duì)FMR1KO小鼠LTP的增強(qiáng)效應(yīng)是否來源于D1受體激動(dòng)劑，我們?cè)诜跤囊后w中同時(shí)加入D1受體抑制劑，發(fā)現(xiàn)這種LTP增強(qiáng)效應(yīng)消失。可以認(rèn)為FMR1KO小鼠LTP的增強(qiáng)效應(yīng)來源于D1受體激動(dòng)劑，這種效應(yīng)是由mGluR1受體拮抗劑恢復(fù)的。
　　2、腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑恢復(fù)D1受體激動(dòng)劑對(duì)FMR1KO小鼠ACC區(qū)LTP增強(qiáng)效應(yīng)
　　為了確定增加腺苷酸環(huán)化酶的量是否能替代D1受體的作用，我們研究了腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑for

10、skolin對(duì)FMR1KO小鼠ACC區(qū)LTP是否有增強(qiáng)作用。發(fā)現(xiàn)加入forskolin且有電刺激誘導(dǎo)的情況下，LTP的幅度與未使用forskolin的FMR1WT小鼠對(duì)照組相比無顯著性差異。與單獨(dú)使用forskolin的FMR1WT小鼠組相比，DL-AP3與forskolin結(jié)合使用并沒有引起FMR1WT小鼠LTP幅度增加。單獨(dú)使用Forskolin并電刺激誘導(dǎo)LTP的FMR1KO未產(chǎn)生明顯的LTP增強(qiáng)效應(yīng)，而聯(lián)合使用forskolin

11、和DL-AP3的FMR1KO小鼠LTP有增強(qiáng)。
　　為了確定多巴胺能介導(dǎo)的LTP效應(yīng)是否需要NMDA受體的激活，我們?cè)诠嗔饕褐屑尤隢MDA受體拮抗劑AP5，發(fā)現(xiàn)SKF81297介導(dǎo)的LTP增強(qiáng)效應(yīng)消失。同樣，LTP增強(qiáng)效應(yīng)在灌流液中加入10mMBAPTA后也被阻斷，表明多巴胺能介導(dǎo)的LTP效應(yīng)需要NMDA受體的激活和突觸后鈣離子濃度增加的。
　　3、mGluR1受體介導(dǎo)的可塑性是經(jīng)由突觸后機(jī)制產(chǎn)生的
　　我們檢測(cè)了AC

12、C區(qū)的雙脈沖易化(PPF)情況。在WT和FMR1KO小鼠ACC區(qū)，灌流液中同時(shí)或分別加入DL-AP3和SKF81297前后，PPF的五個(gè)脈沖間隔產(chǎn)生的突觸后反應(yīng)沒有顯著性差異。結(jié)果表明，突觸前遞質(zhì)釋放沒有改變，mGluR1受體介導(dǎo)的可塑性很可能是經(jīng)由突觸后機(jī)制產(chǎn)生的。
　　4、mGluR1受體拮抗劑不影響突觸的基礎(chǔ)谷氨酸能遞質(zhì)釋放
　　我們檢測(cè)了ACC區(qū)AMPA受體介導(dǎo)的微小興奮性突觸后電流(mEPSCs)。在灌流液中同時(shí)或

13、分別加入DL-AP3和SKF81297，AMPA受體介導(dǎo)的微小興奮性突觸后電流在WT和FMR1KO小鼠ACC區(qū)都沒有發(fā)生顯著性變化。表明mGluR1受體拮抗劑不影響突觸的基礎(chǔ)性谷氨酸能遞質(zhì)釋放。
　　5、AMPA受體的表達(dá)
　　為了確定這種協(xié)同作用對(duì)AMPA受體的表達(dá)和上膜有何影響，我們?cè)谂囵B(yǎng)的PFC細(xì)胞中加入D1受體激動(dòng)劑SKF81297和mGluR1受體拮抗劑DL-AP3。發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用SKF81297或者聯(lián)合使用DL-A

14、P3都會(huì)增加培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經(jīng)元總的GluR1的表達(dá)。而在FMR1KO小鼠，單獨(dú)使用SKF81297或者DL-AP3都沒有改變培養(yǎng)神經(jīng)元總的GluR1的表達(dá)。單獨(dú)使用SKF81297或者聯(lián)合使用DL-AP3都會(huì)增加培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經(jīng)元AMPA受體在膜上的表達(dá)。SKF81297聯(lián)合使用DL-AP3增加了培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經(jīng)元GluR1在膜上的表達(dá)。表明mGluR1受體恢復(fù)了D1受體激動(dòng)劑對(duì)FMR1K

15、O小鼠PFC細(xì)胞AMPAGluR1受體在膜上表達(dá)的增強(qiáng)作用。
　　我們檢測(cè)了DL-AP3和forskolin對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)元GluR1向膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程的影響。發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用Forskolin或聯(lián)合使用DL-AP3都會(huì)增加培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經(jīng)元總的GluR1的表達(dá)。單獨(dú)使用Forskolin或聯(lián)合使用DL-AP3都沒有增加培養(yǎng)的FMR1KO小鼠PFC神經(jīng)元總的GluR1的表達(dá)。而單獨(dú)使用Forskolin或聯(lián)合使用DL-AP3都會(huì)

16、增加培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經(jīng)元GluR1在膜上的表達(dá)。forskolin聯(lián)合使用DL-AP3增加了培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經(jīng)元GluR1受體在膜上的表達(dá)。表明D1受體激動(dòng)劑SKF81297和mGluR1受體拮抗劑DL-AP3在FMR1KO小鼠上的聯(lián)合作用是通過抑制mGluR1受體，激活腺苷酸環(huán)化酶實(shí)現(xiàn)的。
　　6、mGluR5，D1受體和NMDA受體亞型在PFC培養(yǎng)神經(jīng)元上的表達(dá)
　　通過Westernblot

17、檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)mGluR5和D1受體以及NMDA受體的兩個(gè)亞型NR2A和NR2B受體在WT和FMR1KO小鼠ACC區(qū)的表達(dá)水平都沒有顯著性差異。因此，mGluR5和D1受體在ACC區(qū)突觸增強(qiáng)作用受損不是因?yàn)閙GluR5和D1受體以及NR2A和NR2B受體的基礎(chǔ)表達(dá)水平差異引起的。且單獨(dú)使用SKF81297或者SKF81297聯(lián)合使用DL-AP3都不影響NR2A和NR2B亞型在FMR1WT和KO小鼠PFC神經(jīng)元上的表達(dá)。然而，單獨(dú)使用SKF8

18、1297或者SKF81297聯(lián)合使用DL-AP3都顯著性增加了NR2B亞型磷酸化位點(diǎn)Tyr-1472(p-NR2B-Tyr1472)在FMR1WT小鼠PFC培養(yǎng)神經(jīng)元上的表達(dá)。同時(shí)，單獨(dú)使用SKF81297沒有增加NR2B亞型磷酸化位點(diǎn)Tyr-1472(p-NR2B-Tyr1472)在FMR1KO小鼠PFC培養(yǎng)神經(jīng)元上的表達(dá)。而SKF81297聯(lián)合使用DL-AP3能恢復(fù)SKF81297在FMR1KO小鼠PFC培養(yǎng)神經(jīng)元上p-NR2B-T

19、yr1472的表達(dá)增加作用。
　　7、SKF81297與DL-AP3聯(lián)合效應(yīng)對(duì)FMR1KO小鼠行為學(xué)的影響
　　通過行為學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MR1KO小鼠的自發(fā)活動(dòng)能力增加。腹腔注射SKF81297或者SKF81297聯(lián)合使用DL-AP345分鐘后，F(xiàn)MR1WT小鼠的自發(fā)活動(dòng)的運(yùn)動(dòng)距離都沒有顯著性改變。然而，單獨(dú)腹腔注射SKF81297或者SKF81297聯(lián)合使用DL-AP345分鐘后，F(xiàn)MR1KO小鼠自發(fā)活動(dòng)的運(yùn)動(dòng)距離都有顯著性

20、降低。在模擬焦慮行為的高架十字實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MR1KO與WT組小鼠以及單獨(dú)應(yīng)用SKF81297或聯(lián)合使用DL-AP3組之間焦慮指標(biāo)沒有顯著性差異，表明脆性X綜合癥模型小鼠沒有表現(xiàn)出焦慮樣行為，且焦慮樣行為很可能不是通過D1受體通路起作用的。.
　　小鼠每天單獨(dú)腹腔注射SKF81297或者SKF81297聯(lián)合使用DL-AP35周后，進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。對(duì)此后4天FMR1KO和WT小鼠找到平臺(tái)所用時(shí)間分析發(fā)現(xiàn)，在第一天兩組

21、之間就有顯著性差異，F(xiàn)MR1KO組比WT組小鼠找到平臺(tái)所用時(shí)間長(zhǎng)。單獨(dú)使用SKF81297或DL-AP3均不影響FMR1KO和WT小鼠找到平臺(tái)所用時(shí)間，聯(lián)合使用SKF81297和DL-AP3在前3天與同基因型組相比沒有顯著改變，而在第4天，F(xiàn)MR1KO小鼠與聯(lián)合用藥的FMR1KO小鼠組相比有顯著性差異，聯(lián)合使用SKF81297和DL-AP3在第四天顯著降低FMR1KO小鼠找到平臺(tái)所用時(shí)間。FMR1KO和WT小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)過程中的平均游

22、泳速度在組間沒有顯著性差異。
　　8、FMR1KO小鼠ACC區(qū)五羥色胺能突觸可塑性異常
　　為了明確FMR1KO小鼠ACC區(qū)除多巴胺系統(tǒng)外，其他有關(guān)突觸可塑性的遞質(zhì)系統(tǒng)是否正常，我們檢測(cè)了5-HT2A系統(tǒng)在ACC區(qū)有關(guān)突觸可塑性的電生理學(xué)和分子生物學(xué)表現(xiàn)。我們發(fā)現(xiàn)使用5-HT2A受體拮抗劑的WT小鼠能增強(qiáng)LTP效應(yīng)。然而，5-HT2A受體拮抗劑在FMR1KO沒有表現(xiàn)出對(duì)LTP的增強(qiáng)效應(yīng)。電生理實(shí)驗(yàn)表明，與多巴胺系統(tǒng)在FMR1