新生兔缺氧缺血性腦損傷細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)與影像學(xué)實驗研究.pdf

1、新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是由于新生兒窒息，引起腦血供和氣體交換障礙所致的一種全腦性損傷，是嚴(yán)重危害新生兒生命健康的疾病，有較高的發(fā)病率和死亡率，也是造成兒童智能低下、腦癱等神經(jīng)系統(tǒng)殘疾的重要原因之一。HIBD的發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞凋亡(Apoptosis)也參與HIBD，并在其中發(fā)揮獨特的作用。神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的發(fā)生與患兒的預(yù)后有著密切的

2、聯(lián)系。 本實驗通過建立新生兔缺氧缺血性腦損傷模型，對損傷后不同時間點各組動物患側(cè)腦組織進(jìn)行病理組織學(xué)光鏡、電鏡動態(tài)觀察，利用TUNEL染色和免疫組織化學(xué)手段觀察腦組織中凋亡細(xì)胞及其調(diào)控蛋白的動態(tài)表達(dá)規(guī)律，并應(yīng)用Tc-HYNIC-Annexin Ⅴ進(jìn)行活體放射性核素凋亡顯像，探討新生兔缺氧缺血性腦損傷神經(jīng)元凋亡的形態(tài)學(xué)動態(tài)變化、凋亡調(diào)控蛋白動態(tài)表達(dá)規(guī)律及其活體核素凋亡顯像的可行性，為新生兒缺氧缺血性腦損傷神經(jīng)元凋亡的基礎(chǔ)與影像學(xué)研

3、究提供動物實驗依據(jù)。 一、實驗動物 新生8～10天健康日本大耳白兔，雌雄不限，體重100～120g，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實驗動物部提供。 二、實驗試劑 5％鹽酸利多卡因，2O％烏拉坦(氨基甲酸乙酯)，乙醚，醫(yī)用純氧氣和純氮氣，4％多聚甲醛溶液，0.1M磷酸緩沖液，過氧化氫，不同濃度酒精，二甲苯，中性樹膠。TTC(紅四氮唑)，2.5％戊二醛，1％鋨酸，Epon812(環(huán)氧樹脂)(論文一)；兔抗兔Bcl

4、-2和Bax多克隆抗體(一抗)、SABC試劑盒、TUNEL試劑盒和DAB染色液(論文二)；<'99m>TcO<,4><'->，Annenxin V，Sn<'2+>-Fricine Kit和HYNIC(聯(lián)肼尼克酰胺)-Annexin V Kit(論文三)。 三、實驗儀器 缺氧箱，石蠟切片機(jī)，電子天平(ER-185A)，Olympus光學(xué)顯微鏡，JEM-1200EX電鏡，CY-100數(shù)字測氧儀，GE Infinia <'VC

5、> Hawkeye雙探頭SPECT/CT，Philip 3.0 T磁共振。 實驗方法: 論文一：按上述方法制備新生兔缺氧缺血性腦損傷模型，將實驗動物按缺氧缺血后不同時間點分成6組：(1)假手術(shù)對照組n=7；(2)HIBD 1h組n=5；(3)HIBD 4h組：n=5；(4)HIBD 12h組n=5；(5)HIBD 24h組n=5；(6)HIBD 48h組n=7。觀察各組實驗動物處理過程中的行為變化情況；到達(dá)規(guī)定時間后，各

6、組動物經(jīng)4％多聚甲醛心臟灌流后斷頭取腦，取腦時觀察腦組織大體標(biāo)本情況；取假手術(shù)組和HIBD 48h組動物各2只斷頭取腦行TTC染色，觀察有無肉眼可見的梗死灶；每組3只動物腦組織標(biāo)本常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，冠狀切片、片厚5μm，制作HE染色切片，觀察右側(cè)腦組織光鏡病理學(xué)變化；每組2只動物取右側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬和小腦皮質(zhì)，腦組織標(biāo)本經(jīng)2.5％戊二醛固定、1％鋨酸固定、酒精梯度脫水、Epon812包埋、超薄切片，透視電鏡下攝片，觀察腦組織超微

7、結(jié)構(gòu)變化。 論文二：制備新生兔缺氧缺血性腦損傷模型，將實驗動物分成6組：(1)假手術(shù)對照組n=5；(2)HIBD 1h組n=5；(3)HIBD 4h組n=5；(4)HIBD 12h組n=5；(5)HIBD 24h組n=5；(6)HIBD 48h組n=5。各組動物經(jīng)4％多聚甲醛心臟灌流后斷頭取腦，常規(guī)脫水、透明和石蠟包埋。各組取右側(cè)丘腦中1/3平面、小腦位置行冠狀切片，切片厚度為5pm，進(jìn)行TUNEL、Bcl-2和Bax蛋白免疫組

8、化檢測，光鏡下觀察凋亡細(xì)胞、Bcl-2和Bax蛋白在各部位動態(tài)分布。 論文三：制備新生兔缺氧缺血性腦損傷模型，將實驗動物分成6組：(1)假手術(shù)對照組n=5；(2)HIBD 1h組n=5；(3)HIBD 4h組n=5；(4)HIBD 12h組n=5；(5)HIBD 24h組n=5；(6)HIBD48h組n=5。制備<'99m>Tc-HYNIC-Annexin V，各組實驗動物注射顯像劑后1h進(jìn)行SPECT平面活體凋亡顯像；HIBD

9、 48h組動物還分別在注藥后5min、30min、60min和120min顯像；取HIBD 48h組兩只動物，在活體顯像之后，斷頭取腦進(jìn)行裸腦離體顯像。 實驗結(jié)果: 論文一：實驗組動物缺血缺氧處理后5 min出現(xiàn)煩躁不安，20 min時出現(xiàn)呼吸加深加快，鼻翼煽動，40 min至90 min時出現(xiàn)嗜睡，爬行時左后肢呈拖步，90min至2.5 h時嗜睡明顯，部分動物出現(xiàn)短暫性抽搐；假手術(shù)組動物活動狀態(tài)無明顯改變。假手術(shù)對照組

10、、HIBD 1h組、HIBD 4h組兩側(cè)大小腦半球未見明顯異常改變，HIBD 12h組可見右側(cè)大小腦半球與對側(cè)相比，顏色蒼白，呈輕度腫脹，軟腦膜下見輕度出血改變，HIBD 24h組和HIBD 48h組見右側(cè)大小腦半球腫脹明顯，顏色較蒼白，軟腦膜下出血征象明顯，而對側(cè)大小腦半球未見明顯異常。電鏡超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)觀察：小腦皮質(zhì)最先在HIBD 1h出現(xiàn)凋亡征象，其次為大腦皮質(zhì)在HIBD 12h、海馬CA1區(qū)在HIBD 24h出現(xiàn)凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

11、明顯改變，隨損傷時程進(jìn)展各部位細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變明顯，細(xì)胞器損傷加重。 論文二：TUNEL法檢測HIBD后不同時間點凋亡細(xì)胞的動態(tài)變化，光鏡下分別觀察并計數(shù)各組TUNEL法染色切片，標(biāo)記陽性細(xì)胞的細(xì)胞核著棕黃色，胞漿不著色。假手術(shù)對照組大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)和小腦皮質(zhì)未見明顯TUNEL標(biāo)記陽性細(xì)胞表達(dá)；患側(cè)大腦皮質(zhì)在HIBD 12h TUNEL標(biāo)記陽性細(xì)胞表達(dá)明顯；患側(cè)海馬CA1區(qū)在HIBD 24h TUNEL標(biāo)記陽性細(xì)胞表達(dá)明顯；患側(cè)

12、小腦皮質(zhì)在HIBD 4hTUNEL標(biāo)記陽性細(xì)胞表達(dá)明顯。缺氧缺血后時間隨時間推移陽性標(biāo)記細(xì)胞逐漸增多，至HIBD 48 h各部位陽性標(biāo)記細(xì)胞數(shù)達(dá)到最多。 (一)免疫組織化學(xué)檢測Bcl-2蛋白表達(dá)情況假手術(shù)對照組患側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)和小腦皮質(zhì)未見明顯Bcl-2蛋白表達(dá)；患側(cè)大腦皮質(zhì)在HIBD 4h Bcl-2蛋白表達(dá)明顯(陽性表達(dá)細(xì)胞計數(shù)為88.4±1.9)，于HIBD 48h表達(dá)明顯減少；患側(cè)海馬CA1區(qū)在HIBD 4h Bcl

13、-2蛋白表達(dá)明顯(陽性表達(dá)細(xì)胞計數(shù)為73.6±3.2)，于HIBD 48h表達(dá)明顯減少；患側(cè)小腦皮質(zhì)在HIBD 1h Bcl-2蛋白表達(dá)明顯(陽性表達(dá)細(xì)胞計數(shù)為93.6±5.08)，于HIBD 48h表達(dá)明顯減少，P均<0.05。 (二)免疫組織化學(xué)檢測Bax蛋白表達(dá)情況假手術(shù)對照組患側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)和小腦皮質(zhì)未見明顯Bax蛋白表達(dá)；患側(cè)大腦皮質(zhì)Bax蛋白在HIBD 1h表達(dá)較少，在HIBD 12h表達(dá)明顯增多(陽性表達(dá)細(xì)胞計

14、數(shù)為65.6±14.3)；患側(cè)海馬CA1區(qū)Bax蛋白表達(dá)在HIBD 1h表達(dá)較少，在HIBD 24h表達(dá)明顯增多(陽性表達(dá)細(xì)胞計數(shù)為76.4±12.0)；患側(cè)小腦皮質(zhì)Bax蛋白在HIBD 1h表達(dá)較少，在HIBD 4h表達(dá)明顯增多(陽性表達(dá)細(xì)胞計數(shù)為53±6.7)；缺氧缺血后隨時間推移，HIBD 48h時各部位陽性標(biāo)記細(xì)胞數(shù)達(dá)到最多，P均<0.05。 論文三：假手術(shù)組動物<'99m>Tc-HYNIC-Annexin V 活體凋亡

15、顯像未發(fā)現(xiàn)兩側(cè)大腦區(qū)域有異常放射性濃聚，HIBD 4h組動物顯像發(fā)現(xiàn)右側(cè)大腦(患側(cè))局限性放射性輕度濃聚，而對側(cè)呈放射性本底影；HIBD 48h組右側(cè)大腦見明顯放射性異常濃聚，對側(cè)未見異常放射性分布；HIBD 48h組裸腦離體核素凋亡顯像僅見右側(cè)大腦放射性濃聚明顯，左側(cè)大腦呈放射性空白分布。 結(jié)論: 論文一： 1．對新生兔結(jié)扎一側(cè)頸總動脈，給予低氧處理后，可制作成患側(cè)缺氧缺血性腦損傷模型； 2．本研究動物

16、模型屬于輕度腦缺氧血性腦損傷模型，觀察處理后48h尚未造成患側(cè)大腦明顯梗死； 3．病理學(xué)動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)患側(cè)小腦皮質(zhì)對缺氧缺血較為明顯，其次為大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)，上述區(qū)域存在凋亡細(xì)胞，隨損傷后時間推移而明顯。 4．電鏡超微結(jié)構(gòu)動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)患側(cè)小腦皮質(zhì)在損傷因素后較早出現(xiàn)細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)改變，其次為大腦皮質(zhì)和海馬，電鏡可清晰顯示各部位損傷后細(xì)胞核和細(xì)胞器的形態(tài)學(xué)改變。 論文二： 1．在新生兔HIBD模型中，患側(cè)小

17、腦細(xì)胞凋亡較早發(fā)生，其次為大腦和海馬，缺氧缺血后時間隨時間推移凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多。 2．在新生兔HIBD模型中，患側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬、小腦皮質(zhì)在HIBD損傷早期Bcl-2蛋白表達(dá)明顯，但于HIBD 48h表達(dá)明顯減少，而Bax蛋白表達(dá)明顯增多，其中小腦Bax蛋白表達(dá)明顯較早出現(xiàn)，其次為大腦和海馬。 論文三： 1．核素凋亡顯像劑<'99m>Tc-HYNIC-Annexin V在新生兔HIBD損傷后4h即可出現(xiàn)患側(cè)放射