哮喘小鼠肺組織血管生成與FIZZ1，VEGF，HIF-1α表達(dá)相關(guān)性及干預(yù)治療的研究.pdf

1、氣道重塑是支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）的特征性病理改變，表現(xiàn)為氣道平滑肌增生肥大，粘液腺增多，網(wǎng)狀基底膜增厚，此外還表現(xiàn)為氣道粘膜下層和（或）粘膜固有層血管數(shù)目和血管面積的增加，此現(xiàn)象稱為“血管生成”。血管生成是支氣管哮喘氣道重塑的重要組成部分，伴隨氣道重塑發(fā)生發(fā)展。新生血管是炎癥細(xì)胞進(jìn)入氣道壁的門戶，促進(jìn)氣道壁增厚，進(jìn)而引起氣流阻塞和氣道高反應(yīng)性。越來越多的研究表明，哮喘患者肺組織的血管數(shù)目和血管面積較正常人群顯著增加，血管生成在支氣管哮喘

2、的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。近年來，對(duì)于哮喘患者血管生成的組織病理學(xué)有了進(jìn)一步的了解，但是對(duì)血管生成機(jī)制的認(rèn)識(shí)還很欠缺。 哮喘肺組織血管生成是氣道在低氧條件下炎癥反應(yīng)反復(fù)刺激的結(jié)果，細(xì)胞因子在其中發(fā)揮著重要作用。炎癥區(qū)域分子-1（found in inflammatoryzone1，F(xiàn)IZZ1）又稱為抵抗素樣分子α（resistin-like moleculea，RELMα）是近年來發(fā)現(xiàn)的與肺部疾病密切相關(guān)的炎癥因子。FIZZ1和Ym

3、-1同為選擇性活化巨噬細(xì)胞的重要標(biāo)記物。炎癥反應(yīng)時(shí)期，F(xiàn)IZZ1蛋白家族在肺組織表達(dá)水平顯著增加。FIZZ1刺激肺血管平滑肌細(xì)胞和肺內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascularendothelial cell growth factor，VEGF）表達(dá)增高。VEGF是血管生長(zhǎng)關(guān)鍵的影響因子，增加血管通透性，并直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化增殖和遷移，促進(jìn)血管構(gòu)建及生長(zhǎng)。VEGF在低氧環(huán)境下的表達(dá)受缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia

4、inducible factor1α，HIF-1α）的調(diào)控。HIF-1α是存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的氧特異感受器，在缺氧狀態(tài)下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中有重要作用。HIF-1α促進(jìn)下游基因VEGF的表達(dá)，增加血管生成，滿足機(jī)體代謝需要。同時(shí)，血管生成供給炎癥細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)展。研究提示，F(xiàn)IZZ1、HIF-1α和VEGF在血管生成中有重要作用，目前哮喘肺組織血管生成的研究中，上述因子的作用鮮有報(bào)導(dǎo)。 吸入型糖皮質(zhì)激素是控制哮喘的一線用藥，可

5、減輕氣道炎癥反應(yīng)，有抑制血管生成的報(bào)道。作為治療哮喘的激素類藥物之一，布地奈德影響哮喘血管生成的作用機(jī)制研究很少。本研究通過卵清蛋白致敏和激發(fā)小鼠建立哮喘模型，觀察哮喘小鼠肺組織的血管生成變化，以及細(xì)胞因子（FIZZ1和VEGF）在哮喘肺組織血管生成中的作用；并通過霧化吸入布地奈德治療慢性哮喘小鼠，觀察糖皮質(zhì)激素對(duì)肺組織血管生成的影響和HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)的變化，探討布地奈德對(duì)哮喘小鼠血管生成的作用機(jī)制。 第一部分：炎

6、癥區(qū)域分子-1參與哮喘小鼠肺組織血管生成 目的： 血管生成是支氣管哮喘氣道重塑的重要組成部分，伴隨氣道重塑發(fā)生發(fā)展。血管生成在哮喘的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，其相關(guān)機(jī)制成為新近研究的熱點(diǎn)。FIZZ1是近年發(fā)現(xiàn)的與肺部疾病密切相關(guān)的炎癥因子。FIZZ1刺激肺血管平滑肌細(xì)胞和肺內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)VEGF表達(dá)。VEGF是血管生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子，增加血管通透性，并直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化增殖和遷移，促進(jìn)血管的構(gòu)建及生長(zhǎng)。目前尚未見到有

7、關(guān)FIZZ1在哮喘小鼠肺組織血管生成中作用及機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，我們建立哮喘小鼠模型，旨在觀察肺組織血管生成的變化，探討FIZZ1、VEGF蛋白與血管生成的相關(guān)性。 方法： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物分組： 雌性BALB/c小鼠，體重20g-24g，6-8周齡。小鼠隨機(jī)分為6組（n=10）：A組：哮喘模型卵清蛋白（ovalbumin，OVA）霧化刺激7天組；B組：哮喘模型OVA霧化刺激14天組；C組：哮喘模型OVA

8、霧化刺激28天組；D組：健康對(duì)照磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）霧化刺激7天組；E組：健康對(duì)照PBS霧化刺激14天組；F組：健康對(duì)照PBS霧化刺激28天組。D組、E組和F組分別為A組、B組和C組的健康對(duì)照。 2.建立哮喘小鼠模型： A、B、C組小鼠第1天和第14天分別腹腔注射0.2ml OVA致敏劑溶液，第21天開始予OVA霧化刺激，每日30分鐘，建立哮喘小鼠模型。健康對(duì)照組以

9、PBS代替OVA致敏并霧化刺激。 3.肺組織標(biāo)本留?。?霧化刺激7天后，麻醉處死A組和D組小鼠；霧化刺激14天后，處死B組和E組小鼠；霧化刺激28天后，處死C組和F組小鼠；留取肺組織，置于4％多聚甲醛中固定。 4.蘇木素&伊紅染色觀察肺組織病理學(xué)改變。 5.免疫組織化學(xué)染色，觀察血管生成和FIZZ1、VEGF蛋白的表達(dá)。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)論： 哮喘小鼠肺組織血管生成增多，F(xiàn)IZ

10、Z1和VEGF表達(dá)增加，F(xiàn)IZZ1調(diào)控VEGF表達(dá)增高是哮喘小鼠肺組織血管生成增多的可能機(jī)制。 第二部分：霧化吸入布地奈德對(duì)慢性哮喘小鼠缺氧誘導(dǎo)因子-1α及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響 目的： 血管生成在慢性哮喘的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，能增加炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)從而促進(jìn)氣道壁增厚，引起氣道高反應(yīng)性。目前，肺組織血管生成機(jī)制的研究還處于早期階段。HIF-1α在缺氧狀態(tài)下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中有重要作用，能刺激下游基因VEGF的表達(dá)，增加

11、血管生成。VEGF是血管生成和血管滲透性的基本調(diào)節(jié)因子，在血管生長(zhǎng)過程中具有重要作用。吸入型糖皮質(zhì)激素（布地奈德）是控制哮喘的一線藥物。目前有關(guān)糖皮質(zhì)激素影響哮喘血管生成機(jī)制的研究很少，尚未見到有關(guān)布地奈德對(duì)慢性哮喘小鼠肺組織HIF-1α和VEGF表達(dá)影響的報(bào)道。本研究旨在建立慢性哮喘小鼠模型，探討布地奈德影響哮喘肺組織血管生成的作用機(jī)制。 方法： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組： 雌性BALB/c小鼠，30只，體重20g-

12、24g，6-8周齡。將小鼠隨機(jī)分為3組（n=10）：哮喘模型組，治療組和健康對(duì)照組。 2.建立慢性哮喘小鼠模型： 哮喘模型組小鼠第1天和第14天分別腹腔注射0.2mlOVA致敏劑溶液，第21天開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束OVA霧化刺激，每日30分鐘，建立慢性哮喘小鼠模型；健康對(duì)照組以PBS代替OVA致敏和霧化刺激；治療組小鼠造模過程同哮喘模型組，第28天開始每日霧化吸入布地奈德150μg/㎡，1小時(shí)后再予OVA霧化刺激維持哮喘狀態(tài)。

13、 3.肺組織標(biāo)本留?。?治療20周后，麻醉處死哮喘模型組、治療組和健康對(duì)照組小鼠，留取肺組織，部分置于4％多聚甲醛固定，部分置于液氮中保存。 4.蘇木素&伊紅染色觀察肺組織病理學(xué)改變。 5.Masson三色染色法觀察肺組織膠原纖維生成情況。 6.免疫組織化學(xué)染色，觀察肺組織血管生成、HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)。 7.蛋白印記分析（Western blot）技術(shù)檢測(cè)小鼠肺組織HIF-1α

14、和VEGF蛋白的表達(dá)。 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)論： 霧化吸入布地奈德能抑制慢性哮喘小鼠血管生成，降低HIF-1α和VEGF的表達(dá)。血管面積與HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)，提示HIF-1α/VEGF通路是布地奈德抑制慢性哮喘小鼠肺組織血管生成的可能機(jī)制。 第三部分條件免疫反應(yīng)對(duì)慢性哮喘小鼠的作用研究 目的： 條件免疫反應(yīng)（conditioned immune response，CI

15、R）又稱條件反射性免疫反應(yīng)，是根據(jù)經(jīng)典巴甫洛夫條件反射的訓(xùn)練方式，將新異刺激與能夠引起機(jī)體免疫反應(yīng)的非條件刺激相結(jié)合，經(jīng)訓(xùn)練強(qiáng)化后，單獨(dú)呈現(xiàn)條件刺激實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫系統(tǒng)的影響。越來越多的研究表明，條件免疫反應(yīng)和支氣管哮喘的發(fā)作存在密切聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)建立慢性哮喘小鼠模型，以聲音為條件刺激，以布地奈德和沙丁胺醇聯(lián)合霧化吸入為非條件刺激，建立條件免疫反應(yīng)，觀察條件免疫反應(yīng)對(duì)于慢性哮喘小鼠呼吸頻率的影響及肺組織病理學(xué)改變。 方法： 1.

16、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組： 雌性BALB/c小鼠90只，體重20-24g，6-8周齡。將小鼠隨機(jī)分為6組（n=15）： A組：條件免疫反應(yīng)組，以聲音為條件刺激，布地奈德和沙丁胺醇聯(lián)合霧化吸入為非條件刺激，建立條件免疫反應(yīng)，治療20周。 B組：常規(guī)治療組，聯(lián)合霧化吸入布地奈德和沙丁胺醇，1次/日，共20周。 C組：減量治療組，聯(lián)合霧化吸入布地奈德和沙丁胺醇，1次/日，共7天，之后1次/周，共20周。 D

17、組：聲音刺激組，僅給予聲音刺激，1次/日，共20周。 E組：哮喘對(duì)照組。 F組：健康對(duì)照組。 2.建立慢性哮喘小鼠模型： A組、B組、C組、D組和E組小鼠于第1天和第14天分別腹腔注射0.2mlOVA致敏劑溶液，第21天開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束予OVA霧化吸入，1次/日，每次30分鐘，建立慢性哮喘小鼠模型。健康對(duì)照組小鼠，PBS替代OVA致敏和霧化激發(fā)。 3.記錄各組小鼠呼吸頻率的變化。 4.蘇