雌激素受體介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn)方法的建立.pdf

1、雌激素受體報(bào)告基因試驗(yàn)也稱雌激素受體轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn)，是EPA推薦的用于環(huán)境雌激素篩選的in vitro方法之一。雌激素受體報(bào)告基因試驗(yàn)是以受體介導(dǎo)理論為基礎(chǔ)，應(yīng)用基因重組技術(shù)，將報(bào)告基因置于外源性激素反應(yīng)元件(ERE)的調(diào)控之下，構(gòu)建重組報(bào)告基因載體，應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)檢測(cè)化學(xué)物作用下報(bào)告基因編碼的酶活性或蛋白表達(dá)的變化，間接反映內(nèi)源性基因的表達(dá)情況。這種方法既可檢測(cè)化學(xué)物與受體的結(jié)合能力，又可檢測(cè)結(jié)合后引起的生物學(xué)效應(yīng)

2、，而且能夠區(qū)分激動(dòng)劑和拮抗劑，與受體結(jié)合試驗(yàn)相比可提供更多的信息，因此成為環(huán)境雌激素篩選的有力工具。本研究構(gòu)建了兩種不同ERα介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn)，并探討了它們對(duì)三種擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥的雌激素活性的影響。 第一部分 目的：建立人ER0a和大鼠ERa介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn)體系，并比較這兩種方法的反應(yīng)性和靈敏度。 方法： 1.將表達(dá)人ER0a配體結(jié)合域和Ga14-BD(酵母轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域)融合蛋白的質(zhì)粒pGa14-E

3、Radef與Ga14反應(yīng)的報(bào)告基因質(zhì)粒pUAS-tk-luc、對(duì)照質(zhì)粒phRL-墩分別轉(zhuǎn)染CV-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方式為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，建立ER介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn)。以E2為陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)方法的篩選效率。 2.將表達(dá)大鼠ERa的質(zhì)粒rERa/pCI與重組Luc報(bào)告基因質(zhì)粒pERE-aug-Luc、對(duì)照質(zhì)粒phRL-tk共轉(zhuǎn)染CV-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方式為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，建立rERa介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn)。以雌二醇(E2)為陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)方法的篩選效率。

4、結(jié)果： 1.在兩種ERa體系中，E2能明顯的誘導(dǎo)Luc的表達(dá)，并呈顯著的劑量-反應(yīng)關(guān)系，10-7M達(dá)到最大值，最大誘導(dǎo)倍數(shù)分別為19.6和21.6倍，EC50為2.4 nM和0.9 nM。 2.用濃度從10-10M到10-8M的DES染毒hERa體系時(shí)，Luc的表達(dá)量與E2相似，且10μM的ICI182，780能完全阻斷這一效果。 結(jié)論： 1.本研究建立的兩種ERa報(bào)告基因試驗(yàn)具有較高的靈敏度和重復(fù)性。E

5、2對(duì)Luc的誘導(dǎo)是ER依賴性的，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。表明該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)能夠用來(lái)檢測(cè)擬雌激素活性的物質(zhì)。 2.在hERα體系中，ICI182,780能有效抑制E2誘導(dǎo)的Luc的表達(dá)，表明hERa體系可以用來(lái)檢測(cè)化學(xué)物的抗雌激素活性。 3.兩種ERα對(duì)報(bào)告基因試驗(yàn)E2的反應(yīng)性無(wú)明顯區(qū)別，兩種體系的靈敏度也相似。 第二部分雌激素受體介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn)方法的應(yīng)用 目的:應(yīng)用兩種雌激素受體介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn)體系檢測(cè)三種擬除蟲(chóng)菊

6、酯類農(nóng)藥的擬或(抗)雌激素活性，并比較它們對(duì)這幾種化學(xué)物的反應(yīng)性和靈敏度。 方法： 1.CV-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染pUAS-tk-1uc、pGa14-ERadef和phRL-tk質(zhì)粒后用三種擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥(氰戊菊酯，氯氰菊酯，芐氯菊酯)染毒，根據(jù)該物質(zhì)能否誘導(dǎo)LUC的表達(dá)，判斷化學(xué)物的ER激動(dòng)作用。根據(jù)該物質(zhì)能否拮抗E2誘導(dǎo)的Luc表達(dá)，判斷化學(xué)物的ER拮抗作用。 2.CV-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染rERα/pCI、pERE-aug-

7、Luc和phRL-tk質(zhì)粒后用三種擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥染毒，根據(jù)該物質(zhì)能否誘導(dǎo)Luc的表達(dá)，判斷化學(xué)物的ER激動(dòng)作用。 結(jié)果： 1.三種擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥在兩種體系中可以誘導(dǎo)Luc的表達(dá)，并呈顯著的劑量一反應(yīng)關(guān)系，在10-4M達(dá)到最大值。 2.三種擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥均無(wú)法抑制10-9M E2所誘導(dǎo)的Luc表達(dá)，結(jié)論1.所研究的三種擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥都具有一定的擬雌激素活性，但活性強(qiáng)度均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于E2。 2.三種擬除蟲(chóng)