基于暈反應指數(shù)的運動病大鼠生物學指標篩選.pdf

1、研究背景：
　　 運動病(motion sickness，MS)又稱暈動病，是一種常見的由于異常加速度刺激引起的以眩暈、皮膚蒼白、出冷汗、流涎、上腹不適，乃至惡心、嘔吐等植物神經(jīng)反應為主的前庭功能紊亂。暈船做為一種運動病，是艦船員常見的航海衛(wèi)生學問題，發(fā)生率較高。暈船會給船員帶來不同程度的生理不適及精神和心理負擔，降低船員的體能、工作效率及應急反應能力。因此，深入研究暈船的原因和發(fā)生機制，探索暈船防治新途徑，對提高航海作業(yè)人員的

2、工作效率和生活質(zhì)量，提高部隊艦船員的戰(zhàn)斗力具有重要的現(xiàn)實意義。
　　 大鼠是運動病研究常用動物模型之一，但大鼠沒有嘔吐反射，這給大鼠運動病評價帶來困難。國內(nèi)外學者常采用異食癖（如高嶺土）作為大鼠運動病嚴重程度的評價方法。近年來，有學者以大鼠暈動病刺激后的排便顆粒數(shù)、排尿量等表現(xiàn)作為運動病的評價指標，即暈反應指數(shù)（Motion sickness index, MSI）。與高嶺土攝人量和自發(fā)活動值相比，該評價指標具有準確性和可重復性

3、。
　　 目前國內(nèi)外沒有一個公認的大鼠運動病生物學評價指標，有研究表明血清精氨酸加壓素(Arginine vasopressin，AVP)、促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotropic hormone，ACTH)、糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoid, GC）、胰島素(Insulin)、一些微量元素(Traceelements)如銅(Copper, Cu)、鐵(Iron，F(xiàn)e)、鋅(Zinc，Zn)以及前庭c-F

4、os的蛋白表達等可能與運動病有關(guān)。
　　 研究目的：
　　 以暈反應指數(shù)作為大鼠運動病的評價指標，對暈反應指數(shù)與運動病可能相關(guān)的生物學指標進行相關(guān)性分析，為建立更為完善的運動病評價指標體系提供實驗依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 通過文獻回顧篩選出幾個可能與運動病有關(guān)的生物學指標。以暈反應指數(shù)作為大鼠運動病的評價指標，分析在模擬暈船刺激條件下血清AVP、ACTH、糖皮質(zhì)激素、胰島素、微量元素Cu、Fe、Zn

5、水平以及腦內(nèi)前庭核c-Fos蛋白表達水平的變化是否與暈反應指數(shù)的變化存在一定的聯(lián)系。具體包括以下幾個部分:
　　 一、模擬暈船刺激條件下大鼠暈反應指數(shù)與部分血清激素和微量元素含量變化的相關(guān)性分析
　　 （一）實驗動物
　　 42只健康雄性SD大鼠（購自上海西普爾-必凱公司），體重228±12 g。動物飼養(yǎng)室環(huán)境溫度22℃±2℃，濕度50％～60％，自由攝食和飲水，自然晝夜節(jié)律光照。
　　 （二）大鼠運動病

6、模型制作
　　 本實驗通過旋轉(zhuǎn)裝置加速度暴露模擬暈船刺激。將SD大鼠無束縛地放入旋轉(zhuǎn)裝置的有機玻璃籠內(nèi)，蓋上籠蓋，啟動裝置，持續(xù)旋轉(zhuǎn)刺激1小時。旋轉(zhuǎn)參數(shù)如下:繞水平軸順時針旋轉(zhuǎn)，以16°/s2的角加速度從0加速至120°/s2，立即以48°/s2的角加速度減速，直至旋轉(zhuǎn)停止為1個旋轉(zhuǎn)周期，如此反復。
　　 （三）暈反應指數(shù)評分
　　 大鼠加速度刺激后，立即記錄實驗大鼠暈反應指數(shù)。大鼠暈反應指數(shù)計算方法如下:糞便顆

7、粒:每粒計1分，無為0分;排尿:有計1.2分，無為0分;立毛:重度為1.2分，輕度為0.6分，無為0分;顫抖:有為1.2分，無為0分。暈反應指數(shù)最終評分結(jié)果為各項計分之總。
　　 （四）檢測指標與方法
　　 1、取材
　　 大鼠加速度暴露刺激后，記錄暈反應指數(shù)，斷頭處死取血。血液2000 rpm×30 min×4℃離心后取上清，置于-80℃保存待測。
　　 2、指標檢測
　　 (1)血清激素檢測<

8、br>　　 血清中胰島素、糖皮質(zhì)激素（皮質(zhì)酮，corticosterone）、AVP和ACTH含量檢測方法為放射免疫法(radioimmunoassay, RIA)。
　　 (2)血清微量元素檢測
　　 利用電感耦合等離子體(inductively coupled argon plasma quantifier, IcAP)檢測血清微量元素Cu、Fe、Zn含量。血清樣品稀釋方法為取0.2 ml血清，去離子水稀釋至5 m

9、l上機檢測。
　　 二、血清胰島素水平改變對大鼠暈反應指數(shù)的影響
　　 （一）實驗動物與分組
　　 48只健康雄性SD成年大鼠（購自上海西普爾-必凱公司），體重259±32 g。動物飼養(yǎng)室環(huán)境溫度22℃±2℃，濕度50％～60％，自由飲水和攝食，自然晝夜節(jié)律變化光照。經(jīng)過適應性喂養(yǎng)后，大鼠被隨機分為空白對照組(n=8)、鏈脲霉素(Streptozocin，STZ)組(n=8)、胰島素組(n=8)、單純旋轉(zhuǎn)組(n=

10、8)、STZ+旋轉(zhuǎn)組(n=8)和胰島素+旋轉(zhuǎn)組(n=8)。
　　 （二）藥物誘導血清胰島素變化動物模型制作
　　 1、大鼠STZ給藥
　　 STZ組和STZ+旋轉(zhuǎn)組大鼠禁食不禁水12小時后，腹腔注射STZ65 mg/kg，所有大鼠在25分鐘完成注射給藥。
　　 2、大鼠胰島素給藥
　　 胰島素組和胰島素+旋轉(zhuǎn)組中的大鼠分批于旋轉(zhuǎn)前30分鐘腹腔注射2 IU/kg胰島素。
　　 （三）大鼠暈動

11、病模型制作
　　 大鼠暈動病模型制作裝置和加速度刺激條件與前面相同。
　　 將胰島素+旋轉(zhuǎn)組大鼠提前30 min腹腔注射2 IU/kg胰島素，與單純旋轉(zhuǎn)組、STZ+旋轉(zhuǎn)組大鼠分批放入裝置中模擬暈船刺激。胰島素組與空白對照組、STZ組大鼠分批于旋轉(zhuǎn)裝置前靜置1小時。
　　 （四）暈反應指數(shù)評分
　　 大鼠模擬暈船刺激后，立即記錄實驗大鼠排便立毛顫抖等情況，并計算暈反應指數(shù)，具體計算方法同前。
　　

12、（五）檢測指標與方法
　　 1、取材
　　 大鼠模擬暈船刺激后，立即記錄暈反應指數(shù)，斷頭處死取血。胰島素組與空白對照組、STZ組大鼠分批靜置1小時后，與其他各旋轉(zhuǎn)組大鼠一起處死取血。血液2000rpm×30 min×4℃離心后取上清，置于-80℃保存待測。
　　 2、指標檢測
　　 RIA法檢測血清胰島素水平。
　　 三、模擬暈船刺激條件下暈反應指數(shù)與大鼠前庭核c-Fos蛋白表達水平的關(guān)系研究

13、r>　　 （一）實驗動物
　　 30只健康雄性SD大鼠（購自上海西普爾-必凱公司），體重264±15 g。動物飼養(yǎng)室環(huán)境溫度22℃±2℃，濕度50％～60％，給予攝食和飲水，自然晝夜節(jié)律光照。
　　 （二）大鼠運動病模型制作
　　 大鼠運動病模型制作裝置和加速度刺激條件同前。旋轉(zhuǎn)刺激1小時。
　　 （三）暈反應指數(shù)評分與分組
　　 旋轉(zhuǎn)刺激后，記錄暈反應指數(shù)。暈反應指數(shù)評分方法同前。按四分位間距

14、法取上四分位數(shù)和下四分位數(shù)為高低暈反應指數(shù)組，每組6只，其余旋轉(zhuǎn)組樣本剔除。
　　 （四）檢測指標與方法
　　 1、取材
　　 SD雄性大鼠模擬暈船刺激結(jié)束記錄暈反應指數(shù)后，立即斷頭處死。于冰片上迅速取下前庭核。
　　 2、指標檢測
　　 Western blot測定前庭核c-Fos蛋白表達量。
　　 四、統(tǒng)計方法
　　 實驗數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進行處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表

15、示。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。三組及三組以上均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩組間差異的顯著性比較用Least Significant Difference(LSD)法。以暈反應指數(shù)為Y，各激素和微量元素指標分別為X，p=0.5為納入標準，p=1.0為剔除標準進行簡單線性回歸分析;以p=0.05為納入標準，p=0.10為剔除標準進行多元線性回歸，分析暈反應指數(shù)與納入指標的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 一、

16、模擬暈船刺激條件下大鼠暈反應指數(shù)與部分血清激素和微量元素含量變化的相關(guān)性分析
　　 以暈反應指數(shù)為應變量Y，血清胰島素、皮質(zhì)酮、ACTH、AVP、Cu、Fe和Zn含量分別為X變量，進行簡單線性回歸分析，p=0.5為納入標準，p=1.0為剔除標準納入Cu、Zn、皮質(zhì)酮、AVP和胰島素5個指標分別為X1、X2、X3、X3、X5，以暈反應指數(shù)為Y進行多元逐步線性回歸，以p=0.05為納入標準，以p=0.10為剔除標準，回歸模型成立(p

17、＜0.05)。模擬暈船刺激后大鼠血清胰島素水平與暈反應指數(shù)存在負相關(guān)關(guān)系。
　　 二、血清胰島素水平改變對大鼠暈反應指數(shù)的影響
　　 STZ給藥后，大鼠血清胰島素水平下降;胰島素給藥后，大鼠血清胰島素水平上升，且差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　 與空白對照組相比，模擬暈船刺激后單純旋轉(zhuǎn)組大鼠暈反應指數(shù)明顯增加(p＜0.05);與空白對照組相比，模擬暈船刺激后STZ+旋轉(zhuǎn)組大鼠暈反應指數(shù)增加(p＜0.05)

18、;與空白對照組相比，模擬暈船刺激后胰島素+旋轉(zhuǎn)組大鼠暈反應指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)
　　 與單純旋轉(zhuǎn)組相比，胰島素+旋轉(zhuǎn)組大鼠暈反應指數(shù)下降，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);與單純旋轉(zhuǎn)組相比，STZ+旋轉(zhuǎn)組大鼠暈反應指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　 胰島素+旋轉(zhuǎn)組大鼠暈反應指數(shù)低于STZ+旋轉(zhuǎn)組，且差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　 三、模擬暈船刺激條件下暈反應指數(shù)與大鼠前庭核c-

19、Fos蛋白表達水平的關(guān)系研究
　　 模擬暈船刺激后，空白對照組、低暈反應指數(shù)組和高暈反應指數(shù)組三組大鼠前庭c-Fos蛋白表達水平差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。與空白對照組比，高暈反應指數(shù)組大鼠c-Fos蛋白表達水平上升，且差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。高暈反應指數(shù)組比低暈反應指數(shù)組大鼠c-Fos蛋白表達水平高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 本實驗以暈反應指數(shù)作為大鼠運動病的評價

20、指標，檢測大鼠模擬暈船刺激后與血清胰島素、糖皮質(zhì)激素、ACTH和精氨酸加壓素水平，以及血清銅、鐵、鋅水平和前庭c-Fos蛋白表達水平，分析這些指標與暈反應指數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清胰島素水平與暈反應指數(shù)相關(guān)。為進一步探討暈刺激下血清胰島素濃度與暈反應指數(shù)的相關(guān)性，通過STZ給藥破壞SD雄性成年大鼠的胰島β細胞，降低血清胰島素水平;以及直接胰島素給藥，增加大鼠血清胰島素水平的方式，觀察兩種不同處理方式的大鼠模擬暈船刺激后暈反應指數(shù)的變化情