GM-CSF抗流感病毒機(jī)制及黃芩苷恩替卡韋組合物抗乙肝病毒藥效學(xué)研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子抗流感病毒機(jī)制研究
　　粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulatingfactor，GM-CSF)最初是從小鼠肺條件培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的一種能刺激粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞形成集落的因子。隨著對其研究的深入，發(fā)現(xiàn)除了促進(jìn)造血祖細(xì)胞的增殖和分化，GM-CSF對成熟白細(xì)胞的功能也有激活作用，有助于增強(qiáng)機(jī)體

2、的抗感染免疫。本研究在前期的工作中首次證實GM-CSF對FM1流感模型小鼠有顯著的保護(hù)作用，經(jīng)GM-CSF預(yù)防治療后，能明顯降低流感模型小鼠肺流感病毒滴度，減輕肺組織病變，提高模型小鼠的生存率，該研究結(jié)果已于2010年發(fā)表于《Cytokine》雜志上。
　　為了在已有的藥效學(xué)研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步闡明GM-CSF抗流感病毒的作用機(jī)制，本論文第一部分從炎癥和細(xì)胞凋亡兩方面對此進(jìn)行了較為系統(tǒng)的實驗探索。沿用之前的預(yù)防治療方式，經(jīng)滴鼻途徑給予

3、BALB/C小鼠GM-CSF7天，劑量為1.34mg/kg/day，然后再對小鼠感染致死量的A型流感病毒FM1，并于感染病毒的第0天、第2天和第4天各選取一定數(shù)量的小鼠進(jìn)行解剖，收獲肺標(biāo)本，分別用ELISA法檢測肺勻漿中的細(xì)胞因子，流式細(xì)胞術(shù)檢測肺組織內(nèi)免疫細(xì)胞的占比，real-time RT PCR技術(shù)檢測肺組織內(nèi)A型流感病毒M基因、NF-κB、caspase3、bax和bcl-2 mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測NF-

4、κB、磷酸化NF-κB、IκB、caspase3、cleaved caspase3、bax和bcl-2蛋白表達(dá)水平，免疫組化檢測肺組織石蠟切片中磷酸化NF-κB和cleaved caspase3的定位表達(dá)。
　　數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)GM-CSF預(yù)防治療后的小鼠肺TNF-α和IFNα/β生成量顯著增加，在病毒感染早期肺組織內(nèi)的天然免疫細(xì)胞的數(shù)量占比也高于模型對照組，而之后這些細(xì)胞因子濃度和粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞數(shù)量占比下降，均低于模型對照組

5、，該結(jié)果表明GM-CSF預(yù)防治療可以在病毒感染初期顯著上調(diào)機(jī)體的抗感染免疫水平并在之后控制機(jī)體的免疫應(yīng)答強(qiáng)度。感染第2天和第4天的A型流感病毒M基因定量分析顯示GM-CSF治療組均顯著低于模型對照組，提示GM-CSF對肺流感病毒載量的有效抑制作用，這可能與GM-CSF及早啟動抗病毒免疫應(yīng)答，控制了病毒的復(fù)制和擴(kuò)散有關(guān)。NF-κB是調(diào)控炎癥因子和干擾素表達(dá)的重要因子，檢測表明小鼠經(jīng)GM-CSF預(yù)防干預(yù)后，肺NF-κB mRNA和磷酸化NF

6、-κB蛋白表達(dá)增加，并且在感染流感病毒后也穩(wěn)定在相當(dāng)水平，而模型組小鼠肺NF-κB mRNA和磷酸化NF-κB蛋白水平在感染病毒后大幅上升，顯著高于GM-CSF干預(yù)組。對細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的檢測表明，GM-CSF可以抑制促凋亡因子bax、caSpaSe3和cleaved caspase3的表達(dá)，增加抑凋亡因子bcl-2的表達(dá)，提示GM-CSF明顯減少流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　根據(jù)上述實驗結(jié)果我們推測GM-CSF對流感模型小鼠的保

7、護(hù)機(jī)制:(1)GM-CSF通過激活NF-κ B信號途徑，促進(jìn)肺抗病毒細(xì)胞因子TNF-α和Ⅰ型IFN生成，并且在感染早期有效募集天然免疫細(xì)胞，從而控制了病毒的復(fù)制和擴(kuò)散。由于病毒載量的顯著抑制，使得炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答一直控制在適度水平，從而避免了炎癥性病理損傷的發(fā)生;(2) GM-CSF上調(diào)抑凋亡因子bcl-2和下調(diào)促凋亡因子bax的表達(dá)，抑制caspase信號途徑的激活，顯著減少了流感病毒誘導(dǎo)的肺細(xì)胞的凋亡和由此導(dǎo)致的嚴(yán)重肺損傷。簡言之

8、，GM-CSF的預(yù)防干預(yù)使機(jī)體抗感染免疫水平在感染之初即顯著上調(diào)，及早啟動的抗病毒免疫應(yīng)答，有效控制了流感病毒的復(fù)制和擴(kuò)散，避免了因高病毒載量導(dǎo)致的過度炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而有效保護(hù)了流感病毒感染小鼠。該研究結(jié)果為GMCSF應(yīng)用于流感的預(yù)治提供了理論基礎(chǔ)。
　　第二部分 恩替卡韋與黃芩苷組合物抗乙肝病毒藥效學(xué)研究
　　黃芩苷(baicalin，BA)是從唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis

9、Georigi)的干燥根中提取的一種黃酮類化合物，藥理作用廣泛，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、解熱、鎮(zhèn)靜、降壓等功效。體外實驗表明，黃芩苷對乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)復(fù)制有一定抑制作用，而黃芩苷藥物作為乙肝治療的輔助用藥在臨床上亦有不錯的療效，但是有關(guān)黃芩苷抗乙型肝炎病毒的機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報道。
　　本論文首次對黃芩苷抗乙肝病毒的作用機(jī)制進(jìn)行了探索。分別以黃芩苷50μM、25μM和12.5μ

10、M作用于HepG22.2.15細(xì)胞模型，采用ELISA和realtime PCR方法分別檢測細(xì)胞上清中HBV抗原和HBV DNA水平，結(jié)果顯示黃芩苷對HBsAg, HBeAg和HBV DNA均有一定抑制作用。Northern blot和realtime RT PCR檢測表明黃芩苷顯著減少HepG22.2.15細(xì)胞內(nèi)的HBV2.1/2.4kb和3.5kb RNA表達(dá)水平，同時發(fā)現(xiàn)黃芩苷顯著下調(diào)宿主細(xì)胞的肝細(xì)胞核因子HNF1α和HNF4α的

11、表達(dá)，而HNF1α和HNF4α都是重要的HBV RNA轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控因子，由此推測黃芩苷可能通過下調(diào)HNF1α和HNF4α的表達(dá)，抑制HBVRNA的轉(zhuǎn)錄生成，繼而影響病毒蛋白的表達(dá)和HBV DNA的合成，從而抑制HBV的復(fù)制。
　　本研究又將恩替卡韋(entecavir，ETV)與黃芩苷配伍，分別在HepG22.2.15細(xì)胞模型和通過對HBV進(jìn)行rtM204V+ rtL180M突變（YMDD主要突變類型之一）并建立的拉米夫定耐藥細(xì)胞

12、模型中考察了恩替卡韋黃芩苷組合物(ETV+BA)對野生型HBV及拉米夫定耐藥突變HBV的抑制效果。結(jié)果表明，在HepG22.2.15細(xì)胞模型中，組合物ETV3nM+BA50μM、ETV0.75nM+BA50μM和ETV0.19nM+BA50μM對野生型HBV的HBsAg, HBeAg和HBVDNA的合成均顯示顯著的抑制作用，較之單獨使用ETV干預(yù)，對HBsAg抑制率分別提高35.05％、35.67％和39.44％，對HBeAg抑制率分別

13、提高10.99％、12.45％和12.46％，對HBV DNA抑制率分別提高10.66％、13.19％和12.17％。而在HBV拉米夫定耐藥細(xì)胞模型中，組合物ETV48nM+BA50μM、ETV16nM+BA50μM、ETV3nM+BA50μM和ETV0.75nM+BA50μM也顯示對HBV rtM204V+ rtL180M突變株的顯著抑制作用，較之單獨使用ETV干預(yù)，對HBsAg抑制率分別提高30.00％、30.00％、29.58％和

14、32.92％;對HBeAg抑制率分別提高28.88％、31.08％、32.67％和30.94％;對HBV DNA抑制率分別提高37.60％、41.00％、35.80％和33.88％。
　　以上數(shù)據(jù)表明，相比單獨使用ETV干預(yù)，ETV+BA組合物可以提高對野生型HBV和拉米夫定耐藥突變HBV抑制效果，這可能與ETV和BA具有不同抗病毒機(jī)制有關(guān)，ETV主要通過影響病毒聚酶活性抑制HBV DNA的復(fù)制，而BA則通過下調(diào)HNF1α和HNF

15、4α表達(dá)影響HBV RNA的合成，兩者配伍組合后，作用機(jī)制上的互補(bǔ)使得抗HBV效果得以提升。另外，由于HBVYMDD變異株對ETV敏感性明顯減弱，而BA的通過下調(diào)宿主的肝細(xì)胞核因子影響HBV復(fù)制，抗HBV效果不受病毒變異影響，使得ETV+BA組合物對HBVYMDD突變株的抑制效果提升更為顯著，提示ETV+BA組合物在治療HBV拉米夫定耐藥株感染方面可能更具優(yōu)勢。
　　本研究還采用口服給藥方式在鴨乙肝動物模型中進(jìn)一步考察了該組合物在

16、體內(nèi)的抗DHBV療效。通過斑點印跡雜交和Southern印跡雜交檢測治療后的鴨血清和肝臟DHBV DNA水平。結(jié)果顯示，組合物ETV0.1 mg/kg/d+BA250mg/kg/d和ETV0.025mg/kg/d+BA250mg/kg/d治療13天后，對鴨血清DHBVDNA的抑制率分別達(dá)53.61％和46.96％，比單獨使用ETV治療的抑制效果分別提高14.74％和15.03％;對鴨肝臟DHBV DNA的抑制率分別達(dá)72.6％和62.8