關(guān)于CD147通過(guò)IGFBP2調(diào)控惡性黑色素瘤凋亡的體內(nèi)外相關(guān)研究.pdf

1、目的:
　　惡性黑素瘤(malignant melanoma，MM)是來(lái)源于黑色素細(xì)胞的一種侵襲力強(qiáng)、轉(zhuǎn)移性高、進(jìn)展迅速、預(yù)后極差的高度惡性腫瘤，其發(fā)病率隨著近年來(lái)環(huán)境惡化呈上升趨勢(shì)。目前臨床上放化療的主要目的是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，凋亡的機(jī)制研究也就成為了腫瘤細(xì)胞生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。CD147分子是一種在多種腫瘤中高表達(dá)的跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族。本研究組前期研究證實(shí)CD147在皮膚MM細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并參與了腫瘤組織侵襲、遠(yuǎn)

2、處轉(zhuǎn)移和腫瘤血管新生。近年來(lái)的研究表明CD147參與了MM細(xì)胞的凋亡，而其機(jī)制尚不清楚。我們通過(guò)蛋白芯片技術(shù)，探討CD147參與MM凋亡的作用及內(nèi)在機(jī)制，初步探討了CD147作為臨床腫瘤治療靶點(diǎn)的可能性。
　　本研究中，我們首先建立了CD147敲降的皮膚MM(A375-sh-CD147)細(xì)胞株，明確了CD147干擾對(duì)A375細(xì)胞凋亡的影響;通過(guò)人凋亡抗體芯片，找出了與CD147相互作用的凋亡相關(guān)蛋白譜，在這一系列蛋白中IGFBP2

3、(Insulin-like Growth Factor BindingProtein2)受CD147調(diào)控最顯著;我們隨后證實(shí)了CD147可以通過(guò)Akt/mTOR途徑調(diào)控IGFBP2的表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)MM細(xì)胞的凋亡;同時(shí)通過(guò)裸鼠皮下成瘤模型進(jìn)一步在體內(nèi)水平明確CD147-IGFBP2與凋亡的相互關(guān)系。最后，我們利用MM組織芯片，在大樣本量臨床組織中證實(shí)了CD147和IGFBP2表達(dá)的相關(guān)性。本研究旨在明確CD147分子在皮膚MM凋亡中的作用

4、及調(diào)控機(jī)制，為臨床MM抗凋亡治療提供創(chuàng)新的靶分子。
　　方法:
　　1.運(yùn)用shRNA干擾技術(shù)抑制CD147的表達(dá)，Western Blot鑒定轉(zhuǎn)染有效性，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(A375-sh-CD147-C1/C2)。
　　2.運(yùn)用凋亡的相關(guān)檢測(cè)方法，包括Western Blot檢測(cè)cle-PARP和PTEN、電鏡檢測(cè)A375-sh-ctrl和A375-sh-CD147兩組細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變、Annexin V FI

5、TC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞組的凋亡情況。
　　3.應(yīng)用人細(xì)胞凋亡的抗體芯片對(duì)A375-sh-ctrl和A375-sh-CD147兩組細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行檢測(cè)，運(yùn)用LuxScan10K-A掃描、并采用Cluster軟件比較分析找出受CD147調(diào)控的凋亡相關(guān)蛋白譜。
　　4.CD147和IGFBP2相互關(guān)系的研究:Western Blot和RealTime-PCR技術(shù)驗(yàn)證差異蛋白質(zhì)IGFBP2在各組細(xì)胞的表達(dá)情況;免疫共沉

6、淀法檢測(cè)CD147和IGFBP2二者是否直接相互作用;WesternBlot檢測(cè)信號(hào)通路蛋白Akt/mTOR在A375-sh-ctrl和A375-sh-CD147細(xì)胞組中的表達(dá);在A375-sh-ctrl細(xì)胞中加入Akt信號(hào)通路抑制劑后，檢測(cè)IGFBP2的表達(dá)是否有變化。
　　5.構(gòu)建裸鼠MM皮下異種移植模型，分為A375-sh-ctrl組和A375-sh-CD147組;運(yùn)用免疫組化檢測(cè)CD147和IGFBP2的表達(dá);并運(yùn)用TUN

7、EL技術(shù)檢測(cè)兩組的凋亡情況;免疫組化檢測(cè)cle-PARP的表達(dá)。
　　6.運(yùn)用皮膚MM組織芯片研究CD147和IGFBP2的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.成功建立CD147shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆(A375-sh-CD147-C1，A375-sh-CD147-C2)，Western Blot表明其抑制率分別為86.21％±8.30％，和28.9％±5.72％（P均＜0.01），選擇抑制效果較好的細(xì)胞克隆A375-sh

8、-CD147-C1（簡(jiǎn)寫(xiě)為A375-sh-CD147）用于開(kāi)展后續(xù)的研究工作。
　　2.用5氟尿嘧啶(150μg/mL)處理細(xì)胞，誘導(dǎo)凋亡
　　2.1)相對(duì)A375-sh-ctrl細(xì)胞，在A375-sh-CD147細(xì)胞中， cle-PARP的表達(dá)明顯增高3.12±0.22倍(P＜0.01)，PTEN的表達(dá)也顯著增高3.42±0.28倍(P＜0.01);
　　2.2)相對(duì)A375-sh-ctrl細(xì)胞，A375-sh-CD

9、147細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)環(huán)狀、凝塊狀的核染色質(zhì)或星月?tīng)钚◇w（凋亡小體）等一系列凋亡細(xì)胞特征;
　　2.3)相對(duì)A375-sh-ctrl細(xì)胞，A375-sh-CD147細(xì)胞的凋亡率明顯增高4.38±0.25倍(P＜0.01)。
　　3.人細(xì)胞凋亡抗體芯片檢測(cè)A375-sh-ctrl和A375-sh-CD147細(xì)胞組，發(fā)現(xiàn)包括IGFBP2等9個(gè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有明顯差異(P均＜0.01)。
　　4.CD147可以調(diào)控IGFBP

10、2:
　　4.1)IGFBP2蛋白在A375-sh-CD147細(xì)胞中的表達(dá)，相對(duì)A375-sh-ctrl細(xì)胞明顯降低2.91±0.23倍(P＜0.01)，同時(shí)IGFBP2 mRNA的表達(dá)也顯著降低3.42±0.28倍(P＜0.01)。
　　4.2)CD147和IGFBP2沒(méi)有直接發(fā)生相互作用;
　　4.3) p-Akt在A375-shRNA-CD147細(xì)胞中的表達(dá)降低了3.84±0.22倍，p-mTOR的表達(dá)也顯著降低

11、2.42±0.20倍（P均＜0.01），證明CD147可能通過(guò)Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控IGFBP2的表達(dá);
　　4.4)加入Akt信號(hào)通路抑制劑后，IGFBP2的表達(dá)明顯降低3.69±0.74倍(P＜0.01)，證實(shí)了Akt信號(hào)通路可以上游調(diào)控IGFBP2蛋白的產(chǎn)生。
　　5.5.1)成功構(gòu)建了裸鼠MM皮下異種移植模型;
　　5.2)相對(duì)于A375-sh-ctrl組的瘤體，CD147和IGFBP2的表達(dá)在A375-

12、sh-CD147組的瘤體中都顯著降低(P＜0.01);
　　5.3) A375-sh-CD147組的瘤體凋亡顯著增加(P＜0.01);
　　5.4)cle-PARP在A375-sh-CD147組的瘤體中的表達(dá)也明顯增加(P＜0.01)。
　　6.運(yùn)用皮膚MM組織芯片檢測(cè)了192例臨床組織中CD147和IGFBP2的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)正相關(guān)，并且二者在轉(zhuǎn)移性MM中的表達(dá)都顯著高于原位MM(P＜0.05)。