?？挡窈?s-rDNA間隔序列分析及品質(zhì)研究.pdf

1、柴胡是一種常用中藥，也是多種中成藥的主要原料藥材，在中國(guó)應(yīng)用已有2000多年的歷史。2005版《中華人民共和國(guó)藥典》記載柴胡的來源為傘形科植物柴胡(Bupleurum chinense DC.)、狹葉柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Wild.)的干燥根。但在實(shí)際應(yīng)用中，柴胡的商品來源非常復(fù)雜，柴胡屬植物的絕大部分種類在產(chǎn)地均作柴胡藥用，即使已被證明具有毒性的大葉柴胡也不例外。目前，柴胡用藥和出口需求量大，使其

2、野生資源日益枯竭。為滿足需求量不斷擴(kuò)大的中藥柴胡市場(chǎng)，近年來，柴胡人工種植在我國(guó)許多地區(qū)得到很大的發(fā)展?！氨？挡窈笔且院笔”？悼h的地名命名，為產(chǎn)地名稱，其實(shí)際物種經(jīng)鑒定為北柴胡。湖北?？凳a(chǎn)柴胡，有豐富的野生資源，又是優(yōu)質(zhì)地道藥材柴胡的主要栽培生產(chǎn)地區(qū)。近幾年來，保康地區(qū)人工種植柴胡面積不斷增加。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)爻鼼AP推薦的北柴胡外，還有少量的南柴胡和竹葉柴胡品種，加上藥農(nóng)多為自由種植，缺乏規(guī)范的管理和準(zhǔn)確的種質(zhì)鑒定，導(dǎo)致栽培用種

3、不確切，藥材品質(zhì)參差不齊。 本文通過高效液相色譜法(HPLC法)，測(cè)定6個(gè)不同地區(qū)柴胡主要有效成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量，判斷柴胡品種是否優(yōu)良；再提取6個(gè)柴胡樣品的總DNA，進(jìn)行5s-rDNA間隔序列的PCR擴(kuò)增和測(cè)序，研究了其遺傳多樣性。對(duì)我省柴胡GAP工作的品種質(zhì)量鑒定和引種生產(chǎn)具有理論和實(shí)際意義。 1.柴胡皂苷a、d的含量測(cè)定采用 HPLC 法對(duì)6個(gè)樣品中的柴胡皂苷a、d進(jìn)行了含量測(cè)定。對(duì)HPLC的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)

4、行了比較，最終確定使用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱；乙腈-水(40：60)為流動(dòng)相，流速為 1.0mL·min<'-1>；檢測(cè)波長(zhǎng)為 204nm；柱溫為30℃。 對(duì)其進(jìn)行了方法學(xué)考察，平均回收率分別為 99.29％、99.44％，RSD 分別為0.73％、0.82％。結(jié)果證明所用方法準(zhǔn)確可靠，可用于柴胡中柴胡皂苷a、d的含量測(cè)定。同時(shí)得出結(jié)果：湖北?？礕AP示范基地所栽培的北柴胡品種與河南肖店栽培種北柴胡品質(zhì)更佳，馬橋安

5、家灣和馬橋董家溝村與馬橋安家灣栽培種三島柴胡的柴胡皂苷a、d含量相近。栽培種北柴胡的柴胡皂苷a、d的含量明顯高于野生北柴胡。 2.5s-rDNA間隔序列分析實(shí)驗(yàn)采用試劑盒法提取6個(gè)樣品葉片的總DNA，對(duì) PCR 的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行了一系列的比較和探索，包括DNA的提取方法、Taq酶的用量、dNTP的濃度、PCR反應(yīng)等條件的優(yōu)化，建立了優(yōu)化反應(yīng)體系，并且利用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，得到其5s-rDNA間隔序列。對(duì)這些序列進(jìn)行了分析和比較，

6、構(gòu)建了聚類系統(tǒng)樹。 結(jié)果： 1.6種柴胡樣品的 5s-rDNA間隔序列具有相似的堿基序列，6種近似的5s-rDNA間隔序列長(zhǎng)度范圍為270～321bp，G+C％含量為30.7～36.5％，應(yīng)用Mega 3.0軟件進(jìn)行序列分析，得到遺傳關(guān)系聚類圖和樣品相關(guān)系數(shù)，表明了不同產(chǎn)地柴胡間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。樣品相關(guān)系數(shù)范圍在1～17.25之間，種間 5s-rDNA間隔序列差異大于種內(nèi)，道地藥材之間的遺傳距離較小，影響各樣品遺傳距離的