HDAC5在NOD鼠脾CD4+T細(xì)胞中的異常表達(dá)與糖尿病腎病的關(guān)系.pdf

1、糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是一種常見和嚴(yán)重的以微血管病變?yōu)橹鞯奶悄虿〔l(fā)癥，是終末期腎病(end-stage renaldisease，ESRD)的主要原因之一，我國(guó)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。其發(fā)病原因和病理機(jī)制仍不明確，大部分的研究認(rèn)為與高血糖、血流動(dòng)力學(xué)改變、遺傳和環(huán)境因素、性別因素、糖尿病持續(xù)時(shí)間等密切相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞過度活化以及炎性浸潤(rùn)是糖尿病腎損傷的主要免疫病理機(jī)制。而表觀遺傳在調(diào)節(jié)T

2、細(xì)胞基因表達(dá)以及細(xì)胞分化成熟、活化中起重要作用。
　　表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是20世紀(jì)80年代逐漸興起的新興學(xué)科，是指在基因編碼的DNA序列不變的前提下，通過某些機(jī)制產(chǎn)生可遺傳的基因表達(dá)或細(xì)胞表型的改變。其主要機(jī)制包括DNA甲基化(DNA methylation)、組蛋白修飾(Histone Modification)和小RNA干擾(microRNA interference)等。其中組蛋白乙?；亲钪匾男揎椫唬?/p>

3、是基因表達(dá)的主要驅(qū)動(dòng)力。組蛋白的乙?；揎検窃诮M蛋白乙?；?Histone acetyltransferase，HATs)和組蛋白去乙酰化酶(Histonedeacetyltransferase，HDACs)的共同調(diào)節(jié)下維持動(dòng)態(tài)平衡，并與基因的轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域的核心組蛋白乙?；潭雀?，而轉(zhuǎn)錄關(guān)閉區(qū)域核心組蛋白乙?；潭鹊?。HAT能乙?；诵慕M蛋白，使相關(guān)區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，起始轉(zhuǎn)錄;HDAC能去除核心組蛋白的乙?；揎?/p>

4、，使相關(guān)區(qū)域染色質(zhì)超螺旋，抑制RNA聚合酶以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，關(guān)閉轉(zhuǎn)錄。HDACs與HATs的功能相反，能通過去除組蛋白乙酰化修飾來關(guān)閉轉(zhuǎn)錄。人類中已發(fā)現(xiàn)的HDACs共有18種，根據(jù)與釀酒酵母的三種HDACs(apd3、Hdal和Sir2)的同源性可分為三類:第1類與酵母的apd3同源且結(jié)構(gòu)相近，包括HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、HDAC11;第2類與酵母Hdal有相近的催化結(jié)構(gòu)，又可分為A亞類和B亞類，Ⅱ

5、A類是轉(zhuǎn)錄共遏制因子(Corepressor)，包括HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9。ⅡB類包括HDAC6、HDAC10。第2類與第1類催化活性相近，但結(jié)構(gòu)和功能上卻明顯不同;第3類與酵母中的Sir2同源，目前已鑒定出7種，分別為SirT1-7。
　　隨著研究的不斷推進(jìn)，大量我們已經(jīng)了解和明確的分子機(jī)制牽涉進(jìn)糖尿病并發(fā)癥特別是DN的病理機(jī)制中。蛋白激酶C(Proteinkinase C，PKC)和活性氧(reacti

6、ve oxygen species，ROS)是現(xiàn)在公認(rèn)的導(dǎo)致糖尿病腎損傷的重要信號(hào)分子。大量促炎癥因子和促纖維化因子例如:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-b1，TGF-b1)，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factors，CTGF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-smoo

7、th muscle actin，a-SMA)和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)蛋白等在糖尿病患者腎臟表達(dá)上調(diào)。內(nèi)源性抗纖維化細(xì)胞因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein-7，BMP7)和 E-鈣粘蛋白的表達(dá)降低。多種促或抗纖維化相關(guān)基因在DN患者腎臟細(xì)胞的異常表達(dá)提示我們，可能有某種上游分子機(jī)制的失衡影響了相關(guān)基因的表達(dá)。組蛋白去乙酰化酶(HDAC)可以通過調(diào)節(jié)組蛋白的乙?；?/p>

8、水平調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。有研究表明HDAC抑制劑能有效保護(hù)DN患者的腎臟，明顯緩解臨床癥狀。提示我們HDAC表達(dá)異?？赡軈⑴c到DN的病理過程中。通過比較非肥胖型糖尿病小鼠(non-obese diabetic mouse，NOD)發(fā)病前后的腎臟病理，發(fā)現(xiàn)發(fā)病后的NOD鼠腎小球中有T、B和CD11c+樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有IgG和補(bǔ)體C3的沉積。此外，從NOD鼠的血清中可以檢測(cè)到抗自身腎小球成分的自身抗體。而這些現(xiàn)象在未發(fā)病的非糖尿病NOD小鼠

9、中未觀察到。可見，糖尿病腎病的發(fā)生與免疫細(xì)胞的功能異常密切相關(guān)。本研究前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照相比1型糖尿病患者CD4+T細(xì)胞組蛋白H3，H4乙?；黠@降低，HDAC5表達(dá)水平顯著升高，且H3乙酰化降低水平與患者血糖水平明顯負(fù)相關(guān)。提示我們CD4+T細(xì)胞總體組蛋白低乙?；约癏DAC5表達(dá)異常升高可能導(dǎo)致其功能異常，進(jìn)而參與到糖尿病及糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中。本課題選用糖尿病模型NOD鼠為研究對(duì)象，通過檢測(cè)NOD鼠發(fā)病過程中CD4+T細(xì)胞

10、總體H3，H4乙?；揭约癏DACs的改變，并與相關(guān)指標(biāo)做相關(guān)性分析，進(jìn)一步明確CD4+T細(xì)胞組蛋白乙?；揎棶惓ＥcDN發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系。
　　第一部分脾臟CD4+T細(xì)胞組蛋白乙?；揎椗cNOD鼠糖尿病腎病發(fā)病的關(guān)系
　　第一節(jié)不同周齡NOD鼠脾臟CD4+T細(xì)胞H3，H4總體乙酰化水平和相關(guān)修飾酶譜的研究
　　目的:
　　檢測(cè)不同周齡NOD鼠脾臟CD4+T細(xì)胞H3，H4總體乙?；胶拖嚓P(guān)修飾酶譜。
　

11、　方法:
　　將NOD鼠進(jìn)食飲水自由隨機(jī)分為4組，于12，18，24和30周取NOD小鼠脾臟分離CD4+T細(xì)胞，抽提組蛋白，總RNA和總蛋白。用美國(guó)Epigentek公司的H3，H4總體乙?；疎LISA試劑盒檢測(cè)NOD鼠CD4+T細(xì)胞組蛋白H3，H4總體乙?；?。實(shí)時(shí)定量PCR(Real Time PCR)檢測(cè)NOD鼠脾臟CD4+T細(xì)胞組蛋白乙?；嚓P(guān)修飾酶的mRNA水平。Western Blot進(jìn)一步驗(yàn)證Real Time P

12、CR篩選出的陽(yáng)性基因，并將異常表達(dá)的修飾酶與H3，H4乙?；鱿嚓P(guān)性分析。明確NOD鼠脾臟CD4+T細(xì)胞H3，H4乙?；男揎棤顟B(tài)，探討其與DN的相互關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　通過檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)，隨著疾病的發(fā)展24和30周齡NOD鼠脾臟CD4+T細(xì)胞H3，H4總體乙?；矫黠@低于12周齡小鼠，而且周齡越大H3，H4總體乙酰化水平越低。18周齡鼠H3，H4總體乙?；铰缘陀?2周齡鼠。Real Time PCR檢測(cè)乙?；嚓P(guān)修

13、飾酶發(fā)現(xiàn)與12周齡NOD鼠相比，24周齡和30周齡鼠P300，PCAF，HDAC2mRNA水平明顯下降，而HDAC5 mRNA水平則顯著性升高，CREBBP表達(dá)水平無變化。18周齡NOD鼠與12周齡鼠相比僅HDAC5 mRNA水平略有升高，其余無顯著性差異。Western Blot結(jié)果顯示24和30周齡NOD鼠脾臟CD4+T細(xì)胞HDAC5蛋白表達(dá)水平明顯高于12周齡鼠。
　　結(jié)論:
　　隨著NOD鼠疾病的進(jìn)展，其脾CD4+T

14、細(xì)胞總體H3，H4乙?；矫黠@降低，組蛋白去乙?；窰DAC5表達(dá)水平明顯升高，且二者呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　第二節(jié) NOD鼠CD4+T細(xì)胞異常的組蛋白乙?；揎椗c糖尿病腎病相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系
　　目的:
　　檢測(cè)不同周齡NOD小鼠隨機(jī)血糖和微量尿白蛋白排泄量，并與對(duì)應(yīng)的CD4+T細(xì)胞H3，H4總體乙?；胶虷DAC5水平做相關(guān)性分析，明確CD4+T細(xì)胞中HDAC5表達(dá)水平與DN的關(guān)系。
　　方法:
　　每周用

15、血糖儀和試紙檢測(cè)NOD小鼠的隨機(jī)血糖，取12，18，24和30周每只NOD小鼠血糖記錄分析。提尾反射法收集各周齡小鼠尿液，美國(guó)RB公司的ELISA試劑盒分別檢測(cè)尿白蛋白和肌酐，計(jì)算尿白蛋白/肌酐比率得出尿白蛋白排泄率。
　　結(jié)果:
　　與12周齡鼠相比24和30周齡鼠血糖濃度以及尿白蛋白/肌酐比率顯著升高，18周齡NOD鼠血糖略有升高，尿白蛋白/肌酐比率無明顯變化。24和30周齡鼠H3，H4乙?；脚c尿白蛋白/肌酐比率顯著

16、負(fù)相關(guān)，HDAC5水平與尿白蛋白/肌酐比率顯著正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　CD4+T細(xì)胞中HDAC5的異常升高與NOD鼠腎功能的損害密切相關(guān)。
　　第二部分 siRNA表達(dá)質(zhì)粒干擾組蛋白去乙?；窰DAC5的表達(dá)
　　目的:
　　利用siRNA技術(shù)構(gòu)建HDAC5的干擾質(zhì)粒，篩選出有效干擾靶點(diǎn)，為后期干預(yù)NOD鼠脾臟CD4+T細(xì)胞做準(zhǔn)備。
　　方法:
　　根據(jù)genebank提供的HDAC5 mRN

17、A序列，使用ambion提供的在線設(shè)計(jì)工具BLOCK-iTTM RNAi Designer查找干擾靶點(diǎn)。將待選靶序列克隆進(jìn)pLKD.CMV.G&PR.U6.shRNA質(zhì)粒，并將克隆成功的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染小鼠CD4+T細(xì)胞，Real Time PCR和Western Blot檢測(cè)干擾效率，篩選出有效靶點(diǎn)。
　　結(jié)果:
　　利用BLOCK-iTTM RNAi Designer找出4條評(píng)分最高的HDAC5干擾靶點(diǎn)，并成功克隆進(jìn)干擾載體。

18、通過Real Time PCR和WesternBlot檢測(cè)出siRNA-HDAC5-2干擾效果最好。
　　結(jié)論:
　　siRNA技術(shù)可成功干預(yù)小鼠CD4+T細(xì)胞HDAC5的表達(dá)。
　　第三部分 siRNA-HDAC5對(duì)NOD鼠組蛋白修飾異常的干預(yù)及其治療作用
　　目的:
　　通過干預(yù)NOD鼠脾臟CD4+T細(xì)胞HDAC5的表達(dá)，檢測(cè)腎功能相關(guān)指標(biāo)，評(píng)估siRNA-HDAC5對(duì)NOD鼠的治療作用，進(jìn)一步明確HD

19、AC5與DN之間的關(guān)系。
　　方法:
　　將小鼠隨機(jī)分為三組，即siRNA-HDAC5，siRNA-Control和生理鹽水組。于18，24和30周齡取樣本檢測(cè)。Real-time PCR檢測(cè)各組NOD鼠CD4+T細(xì)胞CD11a、CCR5、以及CX3CR1轉(zhuǎn)錄水平。ELISA檢測(cè)各組NOD鼠血清IL-1，IL-6，IL-18和TNF-α水平。血糖儀檢測(cè)各組NOD鼠血糖，ELISA檢測(cè)各組NOD鼠尿白蛋白排泄率。最后常規(guī)病理檢

20、測(cè)各組NOD鼠腎臟。
　　結(jié)果:
　　與未干預(yù)對(duì)照組相比，HDAC5干預(yù)組小鼠脾CD4+T細(xì)胞CD11a、CCR5、以及CX3CR1明顯降低。血清IL-1，IL-6，IL-18，TNF-僅細(xì)胞因子水平，以及血糖和尿白蛋白排泄率均顯著降低。腎臟病理結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，干預(yù)組24周齡鼠腎小球病理?yè)p傷無明顯改變，30周齡鼠僅可見系膜細(xì)胞輕度增生，基質(zhì)略有增多，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)較少，基底膜未見明顯增厚;間質(zhì)內(nèi)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管