重組腺病毒載體介導的反義基質金屬蛋白酶-2基因治療增殖期血管瘤的實驗研究.pdf

1、腫瘤的血管新生(Angiogenesis)理論是由Folkman[1]于上個世紀七十年代首先提出，研究表明血管新生是實體瘤生長和轉移的基礎，腫瘤從新生血管中獲取營養(yǎng)和排泄廢物，腫瘤的微血管數(shù)量幾乎與所有的實體瘤的生長和預后均密切相關。 細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)的降解是血管生成的關鍵一步[2]，基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)是參與基質降解的最重要的蛋

2、白酶，它可以降解已知的所有基質成分[3]。血管瘤的發(fā)生、增殖、消退與細胞外基質有著極其密切的關系，其中基質金屬蛋白酶與血管形成密切相關，是一種重要的促進血管生成的蛋白酶，MMPs促使血管形成在增殖期血管瘤中的作用已引起重視，MMPs已成為治療增殖期血管瘤的重要靶標。通過轉染反義MMP-2基因作基因治療，抑制增殖期血管瘤組織中MMP-2的分泌而降低MMP-2的活性，都將成為增殖性血管瘤治療的重要手段。 本研究采用反義MMP-2cD

3、NA基因在mRNA水平抑制靶基因表達的策略，采用重組腺病毒介導的反義MMP-2cDNA基因感染的方法，感染增殖期血管瘤內皮細胞(vascularendothelialcell,VEC)和人增殖期血管瘤裸小鼠移植瘤，分別從體外和體內實驗兩方面研究反義MMP-2cDNA基因感染對靶細胞或/和組織的生物學特性和血管新生的影響，探討反義MMP-2cDNA基因在治療增殖期血管瘤中的意義，為進一步開展臨床應用研究奠定基礎。該系列研究的目的、方法、結

4、果、結論如下：第一部分重組腺病毒介導的綠色熒光蛋白(Ad-GFP)和重組腺病毒介導的反義基質金屬蛋白酶-2cDNA(Ad-aMMP-2cDNA)的擴增、純化、鑒定和滴度測定目的擴增、純化Ad-GFP和Ad-aMMP-2cDNA，鑒定目的基因，并測定滴度。方法在293腺病毒包裝細胞中復制和擴增Ad-GFP和Ad-aMMP-2cDNA。反復凍融293細胞，提取腺病毒懸液，用氯化銫(CsCl2)梯度離心法純化腺病毒，用PCR方法鑒定目的基因，

5、在熒光顯微鏡下測定Ad-GFP的滴度，用空斑法測定Ad-aMMP-2cDNA的滴度。結果目的基因中含有500bp的人反向插入的MMP-2cDNA片段，獲取了實驗所需的第四代重組腺病毒液(Ad-GFP和Ad-aMMP-2cDNA)，Ad-GFP的滴度為9.5×109efu/ml，Ad-aMMP-2cDNA的滴度為1.0×109pfu/ml。結論該實驗制備了本研究所需的高滴度的Ad-GFP和Ad-aMMP-2cDNA。 第二部分反義

6、MMP-2基因影響人增殖期血管瘤的體外研究目的用Ad-aMMP-2cDNA感染原代培養(yǎng)的增殖期血管瘤內皮細胞后，觀察其對體外培養(yǎng)的VEC生物學特性的影響，為進一步的體內實驗奠定基礎。方法選用不同感染復數(shù)(multiplicityofinfection，MOI)的Ad-GFP感染原代培養(yǎng)的VEC(經形態(tài)學觀察、免疫組化染色和電鏡觀察鑒定確認后)，測定感染效率；用Ad-GFP和Ad-aMMP-2cDNA腺病毒液感染VEC，測定其生長曲線(M

7、TT)；細胞的生長周期和凋亡；分別用RT-PCR、明膠酶試驗、免疫組化和WesternBlotting方法在分子水平和蛋白水平檢測MMP-2基因的表達。結果當MOI=100時，VEC感染效率為84.3％，是理想的感染效率，并且對細胞的毒性作用較小，對VEC的生長沒有明顯的影響，流式細胞儀檢測結果也證明這一點。反義MMP-2能明顯下調腫瘤細胞內源性MMP-2表達。MMP-2免疫組化顯示感染反義MMP-2組表達MMP-2明顯減少。明膠酶試驗

8、和WesternBlotting都說明Ad-aMMP-2能抑制VEC分泌MMP-2，可以有效抑制VEC表達MMP-2。結論①用組織塊法原代培養(yǎng)增殖期血管瘤內皮細胞，經含有G418的培養(yǎng)液兩次處理后，能獲得純度較高的VEC。②腺病毒介導的報告基因GFP在VEC中能夠有效感染并表達。③在體外實驗中，反義MMP-2cDNA可以有效抑制VEC分泌MMP-2。 第三部分反義MMP-2基因影響人增殖期血管瘤的體內研究目的研究反義MMP-2c

9、DNA基因感染對人增殖期血管瘤裸小鼠移植瘤生長的影響。方法將手術切除的人增殖期血管瘤的新鮮標本切分為5mm×4mm×3mm小塊，于1小時內移植于18只裸小鼠雙側腋部皮下，并觀察其生長情況。待移植瘤塊成活后(45天)進行分組治療，共三組：PBS組,Ad-GFP組，Ad-aMMP-2組，每組5只，共15只，隔日瘤內注射一次，共注射四次。進行大體觀察(副作用，腫瘤體積)；組織形態(tài)學的觀察(肉眼觀察、熒光檢測、HE觀察、電鏡觀察)；在蛋白水平檢

10、測反義MMP-2cDNA基因的表達；用流式細胞儀檢測腫瘤細胞的生長周期和凋亡；最后檢測微血管密度(micro-vasculardensity,MVD)的改變。結果成功地建立了荷瘤裸小鼠血管瘤移植模型；Ad-aMMP-2能抑制體內血管瘤的生長，沒有觀察到明顯的毒副作用；組織學切片能觀察GFP基因的表達；Ad-aMMP-2cDNA能夠抑制血管瘤組織表達MMP-2，并導致腫瘤MVD明顯減少。結論通過反義MMP-2基因阻斷人增殖期血管瘤的生長是