載CD44v6-siRNA納米微粒的制備及抗胃癌作用的研究.pdf

1、研究背景：CD44是一種多功能的細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞表面受體。它參與胞外基質(zhì)結(jié)合，細(xì)胞遷移和淋巴歸巢等過程。CD44有多種亞型，包括CD44s(標(biāo)準(zhǔn)型)，CD44E(上皮細(xì)胞型)和CD44v(變異體)。研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)型CD44與維持組織的三維結(jié)構(gòu)有關(guān)。而CD44變異體，特別是CD44v6在胃癌等多種癌癥的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)生長(zhǎng)起重要作用。
　　 近來RNA干擾(RNA interference,RNAi)作為一種有效的基因沉默

2、技術(shù)用于基因治療等方面。自從它的機(jī)制發(fā)現(xiàn)后，小干擾RNA(siRNA)已經(jīng)應(yīng)用于基因功能的分析和疾病治療中。大量研究表明，RNA干擾對(duì)于多種疾病(包括癌癥)的治療具有廣闊的前景。
　　 siRNA的有效運(yùn)輸需要載體系統(tǒng)克服細(xì)胞內(nèi)外的多個(gè)屏障。近來，脂質(zhì)體和陽離子聚合物為基礎(chǔ)的非病毒載體是siRNA體外應(yīng)用中比較常用的運(yùn)載工具。它們與病毒載體相比，具有低免疫原性和高安全性等優(yōu)點(diǎn)。而陽離子聚合物為基礎(chǔ)的非病毒載體與脂質(zhì)體比較，有以下

3、優(yōu)點(diǎn)：安全性更高，方便大規(guī)模生產(chǎn)，高穩(wěn)定性，結(jié)構(gòu)易調(diào)整。在作為非病毒載體的陽離子聚合物中，聚乙烯亞胺(PEI)結(jié)構(gòu)中有多個(gè)胺基基團(tuán)，它能夠復(fù)合帶負(fù)電的DNA或siRNA，產(chǎn)生“質(zhì)子海綿”的效應(yīng)。一些研究表明，PEI的轉(zhuǎn)染率高于其他的陽離子聚合物。然而，PEI的體內(nèi)毒性較大。因此，聚乙二醇(PEG)用來修飾PEI，提高基因轉(zhuǎn)染率并降低了細(xì)胞毒性。
　　 目的：本研究的目的是探索非病毒基因載體聚乙烯亞胺-聚乙二醇(PEI-PEG)和

4、siRNA形成納米微粒的制備、理化性質(zhì)及其在體外轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后對(duì)CD44v6基因的干擾效果。
　　 方法：本研究采用人工合成的PEI-PEG納米材料，以不同的N/P比(即PEI-PEG的胺基基團(tuán)和siRNA的磷酸根基團(tuán)的理論電荷比)，使其與靶向CD44v6基因的siRNA形成復(fù)合物。通過粒徑和電位的測(cè)定、凝膠阻滯試驗(yàn)、掃描電鏡等試驗(yàn)方法，觀察PEI-PEG/siRNA納米微粒的理化性質(zhì)及復(fù)合效果。
　　 以lipo200

5、0/siRNA和PEI(25kDa)/siRNA做對(duì)照，MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測(cè)納米微粒對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞的毒性。
　　 綠色熒光FAM標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901細(xì)胞后，分別用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染率的高低。
　　 用PEI-PEG/siRNA-CD44v6納米微粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后，用RT-PCR和Western Blot試驗(yàn)分別在mRNA水平和蛋白水平分析siRNA對(duì)CD44v6的基因下調(diào)作用。<

6、br>　　 結(jié)果:
　　 1)試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著N/P比的增大，PEI-PEG/siRNA復(fù)合物的粒徑有減小的趨勢(shì)。當(dāng)N/P=30時(shí)，納米微粒的粒徑為(192.1±2.8)nm。
　　 2)同時(shí)N/P比由5增加到10，表面電位逐漸增大，由(-5.76±1.12)mv增加為(26.86±0.76)mv。
　　 3)掃描電鏡下納米微粒的形態(tài)呈大小均一的球形，大小在240nm左右。
　　 4)當(dāng)N/P比為15

7、時(shí)siRNA和PEI-PEG完全復(fù)合，凝膠阻滯試驗(yàn)無條帶出現(xiàn)。
　　 5)流式細(xì)胞儀測(cè)得的細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染率隨著復(fù)合物N/P比增大而增大。當(dāng)達(dá)到N/P=30時(shí)，轉(zhuǎn)染率為75.6±9.2％，高于對(duì)照組lipo2000/siRNA和PEI(25kDa)/siRNA。
　　 6)熒光顯微鏡下顯示，隨著PEI-PEG/siRNA復(fù)合物N/P比增大，轉(zhuǎn)染進(jìn)胃癌細(xì)胞的FAM標(biāo)記的siRNA增多。且N/P=15和30組，細(xì)胞內(nèi)的FAM-s

8、iRNA高于lipo2000和PEI(25kDa)組。
　　 7)MTT試驗(yàn)表明，PEI-PEG的細(xì)胞毒性隨其終濃度增加而增大，PEI-PEG的毒性低于相同終濃度時(shí)PEI的毒性。而且，當(dāng)N/P比小于15時(shí)，PEI-PEG/siRNA的毒性明顯低于lipo2000/siRNA。
　　 8)RT-PCR和Western Blot分析表明在mRNA和蛋白水平siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞的CD44v6基因表達(dá)有下調(diào)作用。CD44v6蛋白

9、表達(dá)下調(diào)到正常59.7±3％的水平。
　　 結(jié)論:
　　 1)本研究表明PEI-PEG作為一種新穎的非病毒基因載體，可與siRNA有效結(jié)合形成納米微粒。
　　 2)PEI-PEG與siRNA復(fù)合成粒徑在200nm左右、帶正電荷的納米微粒，能將siRNA有效的轉(zhuǎn)染進(jìn)胃癌細(xì)胞中。
　　 3)PEI-PEG具有細(xì)胞毒性相對(duì)小、轉(zhuǎn)染率高等優(yōu)點(diǎn)。
　　 4)PEI-PEG/siRNA復(fù)合物對(duì)胃癌細(xì)胞的CD4